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明太魚金蟲 (初入文壇)
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[求助]
連接載體相關(guān) 已有4人參與
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最近一直在做連接，持續(xù)兩個(gè)月了，每次都只長(zhǎng)假菌落，基因三百多bp，連到了18T上，選擇了BanHI和SpeI切（因?yàn)闆]有合適的酶切位點(diǎn)，在基因的非開放讀碼框處選擇了SpeI）并回收，濃度不高大約10納克左右。 連表達(dá)載體，問題就出現(xiàn)了，表達(dá)載體上這兩個(gè)酶切位點(diǎn)距離較近中間只有一個(gè)XbaI，不知道是不是這個(gè)原因，不論是分別切還是直接雙切的都連不上，而且分別切和直接雙切后的載體不在一條線上，找了很多辦法，為了防止假陽性甚至又將酶切后的載體去磷酸化，假陽性是少了可是沒出真的。 用的都是1:3的比例，感受態(tài)用的是實(shí)驗(yàn)室做的Top10,雖說自己做的可能沒有買的好，但是其他同學(xué)用也都連上了，我就不知道該怎么辦了，請(qǐng)各位大神指點(diǎn)一二。 |
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明太魚
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7樓2015-03-30 09:24:46
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2樓2015-03-29 21:51:22
【答案】應(yīng)助回帖
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首先你要做一個(gè)對(duì)照。就是只加載體，不加片段，再加buffer、酶進(jìn)行反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化�？纯词欠衲愕妮d體沒有切開，如果載體沒切開的話，對(duì)照也會(huì)長(zhǎng)出很多假陽性菌落。 如果一直是假陽性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切體系的體積，或者換一管酶。 你的T4連接可以常溫連接過夜，如果仍然不行，也建議你換一罐T4 |
3樓2015-03-29 23:04:21
明太魚
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4樓2015-03-30 09:12:27
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