 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 4 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1840 | 回復(fù): 3 | ||
[求助]
基因組DNA提取問題
|
 最近一直在提副溶血弧菌的基因組DNA，但總是提取失敗，遇到一些問題。我先說一下我的方法：方法一：（1） 1.5mL菌液（每組兩管）4℃ 12000 r/min離心30 s，棄去上清，倒置試管于吸水紙上吸干。 （2） 每管加入400 μL裂解液，用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解，直到液體由渾濁變?yōu)槌吻澹扯仍黾樱?7℃水浴30 min。 （3） 每管加入132 μL的5 M NaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000 r/min離心15 min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1mL槍頭的尖端）小心取出上清液轉(zhuǎn)倒兩支新的eppendorf管中。 （4） 加入等體積的飽和苯酚/氯仿（24:1），充分混勻后，12000 r/min離心3 min，離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質(zhì)，則需將上清液轉(zhuǎn)入新的試管，重復(fù)上述步驟直到水層透明，水層和酚層之間不再白色沉淀物為止（約2次）。 （5） 將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000 r/min離心3 min，除去苯酚。 （6） 小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，用預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30 min，然后13000 r/min離心15 min，可見白色絲狀沉淀物。 （7） 小心吸出液體，棄上清液，用預(yù)冷的400 μL 70％乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用100-200 μL DEPC水（含20 μg/mL的Rnase）溶解DNA。 裂解液（40 mM Tris-醋酸，20mM醋酸鈉,1 mM EDTA,1% SDS,pH 8.0）。 方法二：（1）將待檢測菌株接種于 3 mL LB 或 BHI 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜； 注： 以生長至對數(shù)期的細(xì)菌為最佳提取對象， 因?yàn)檫^對數(shù)期時(shí)培養(yǎng)基中會積聚過度的核酸酶 降解 DNA。 （2）取 1.5 mL 上述菌液于 2 mL 離心管，10,000~15,000 rpm，離心 10~15 min，去 上清（若所得菌體過少可重復(fù)此步驟一次） ； （3）加入 564 μL TE 緩沖液（pH 8.0）重懸菌體（可使用無菌牙簽充分混合菌體使其 完全重懸） 。 （4）加入 30 μL 10%~20% SDS 和 6 m 蛋白酶 μL（10 mg/mL） ，混合均勻、不得渦 旋，置于 37℃（可用金屬浴）條件反應(yīng) 1~2h，使懸液相對清澈有粘性為止。 （5） 加入 100 μL 5M NaCl， 混合均勻、 不得渦旋， 65℃反應(yīng) 2 min。 然后， 加入 80 μLCTAB/NaCl，混合均勻、不得渦旋， 65℃反應(yīng) 10 min。 注：在加入 CTAB/NaCl 之前,必須用 5M NaCl 充分混勻裂解產(chǎn)物，且 CTAB/NaCl 溶液加之 前得先預(yù)熱至 65℃，并且吸取時(shí)移液器槍頭應(yīng)去除尖端。 （6） 加入等體積 （約 800 μL 氯仿/異戊醇（24:1） 充分混勻， ， 10,000 rpm 離心 5 min。 離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 A）至新的 2 mL 離心管中。 （7）加入等體積（約 800 μL）酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）于上清液 A 中，充分混勻， 15,000 rpm 離心 5 min。離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 B） 至新的 2 mL 離心管中。 （8）加入等體積（約 800 μL）氯仿/異戊醇（24:1）于上清液 B 中，充分混勻，10,000 rpm 離心 5 min。離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 C）至新的 2 mL 離心管中。 加入用2倍體積無水乙醇沉淀DNA。 現(xiàn)在遇到的問題是當(dāng)加入SDS進(jìn)行裂解的時(shí)候，總是做不到澄清，也不粘稠，兩個方法都是這樣（第一個方法本科畢設(shè)的時(shí)候用的很好，提出來的足夠用）。換成大腸桿菌，可以澄清粘稠。但是在加入苯酚/氯仿進(jìn)行抽提的時(shí)候，抽提第二次就上下液層澄清程度讓人吃驚，中間也沒蛋白層了，后期根本沉淀不出DNA。感覺方法也沒有錯啊，怎么總是這個樣子，有沒有熟悉的，想請教一下。都提了接近兩周了。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有190人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 酵母基因組提取
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 為什么細(xì)菌基因組提取出來總是23K？
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 提取基因組DNA發(fā)生一件很奇怪的事情
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 植物基因組提取
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 放線菌DNA提取相關(guān)問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- DNA試劑盒提取完DNA后的問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 水體細(xì)菌基因組總DNA的提取
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 放線菌DNA 提取不出來，第一次做這方面的，沒經(jīng)驗(yàn)，還望指正
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 一株芽孢桿菌的DNA提取問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 提取細(xì)菌基因組DNA時(shí)總是會有蛋白殘留
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 關(guān)于DNase1 去除提取的RNA中基因組DNA的問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 提取DNA，濃度一直很低，請叫原因
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 急求魚尾鰭DNA提取問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 提取細(xì)菌基因組DNA
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 有關(guān)基因組提取問題
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 大家來說說做southern blot時(shí)，基因組DNA的提取方法
已經(jīng)有39人回復(fù)
- 關(guān)于DNA提取的一些問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助】植物基因組DNA提取后的電泳檢測
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 細(xì)菌基因組DNA的提取問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【交流/求助】基因組DNA保存
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 基因組DNA提取問題
已經(jīng)有32人回復(fù)
- 全血基因組的提取問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- CTAB 基因提取方法的問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 基因組提取過程中加入溶菌酶有白色沉淀
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 細(xì)菌全基因組提取求助
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于DNA提取后測定OD值的問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
2樓2015-04-03 10:07:58
zqw徒弟
銅蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 25.5
- 散金: 60
- 帖子: 58
- 在線: 39.6小時(shí)
- 蟲號: 3426146
- 注冊: 2014-09-18
- 性別: GG
- 專業(yè): 腫瘤發(fā)生
3樓2015-07-12 09:14:27
衛(wèi)小謄
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 7
- 帖子: 19
- 在線: 15.7小時(shí)
- 蟲號: 3991052
- 注冊: 2015-07-26
- 性別: MM
- 專業(yè): 植物遺傳學(xué)
4樓2015-07-26 17:24:52
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 TNX6 的主題更新
| 4 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 085600材料與化工 +10 | 安全上岸！ 2026-03-16 | 10/500 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +12 | 申子申申 2026-03-19 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 生物學(xué)071000 329分求調(diào)劑 +5 | 我愛生物生物愛?/a> 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 能源材料化學(xué)課題組招收碩士研究生8-10名 +5 | 脫穎而出 2026-03-16 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)070300 學(xué)碩336求調(diào)劑 +5 | vv迷 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 13341 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 【考研調(diào)劑】化學(xué)專業(yè) 281分，一志愿四川大學(xué)，誠心求調(diào)劑 +11 | 吃吃吃才有意義 2026-03-19 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料 271求調(diào)劑 +5 | 展信悅_ 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 22 350 本科985求調(diào)劑，求老登收留 +3 | 李軼男003 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 271材料工程求調(diào)劑
+8
|
.6lL 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿華南師大 070300（化學(xué)）304分求調(diào)劑 +3 | 0703武芊慧雪304 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +4 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿:南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩，總分289分 +4 | @taotao 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +9 | 想上學(xué)吖吖 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 353求調(diào)劑 +3 | 拉鉤不許變 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑，是學(xué)校就去 +8 | sllhht 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +5 | pupcoco 2026-03-17 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料考研調(diào)劑 +3 | xwt。 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[碩博家園] 湖北工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院-課題組招收2026級食品/生物方向碩士 +3 | 1喜春8 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿蘇州大學(xué)材料工程（085601）專碩有科研經(jīng)歷三項(xiàng)國獎兩個實(shí)用型專利一項(xiàng)省級立項(xiàng) +6 | 大火山小火山 2026-03-16 | 8/400 |
|