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基因組DNA提取問題
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 最近一直在提副溶血弧菌的基因組DNA，但總是提取失敗，遇到一些問題。我先說一下我的方法：方法一：（1） 1.5mL菌液（每組兩管）4℃ 12000 r/min離心30 s，棄去上清，倒置試管于吸水紙上吸干。 （2） 每管加入400 μL裂解液，用移液槍槍頭反復(fù)抽吸輔助裂解，直到液體由渾濁變?yōu)槌吻澹扯仍黾樱?7℃水浴30 min。 （3） 每管加入132 μL的5 M NaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000 r/min離心15 min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1mL槍頭的尖端）小心取出上清液轉(zhuǎn)倒兩支新的eppendorf管中。 （4） 加入等體積的飽和苯酚/氯仿（24:1），充分混勻后，12000 r/min離心3 min，離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質(zhì)，則需將上清液轉(zhuǎn)入新的試管，重復(fù)上述步驟直到水層透明，水層和酚層之間不再白色沉淀物為止（約2次）。 （5） 將上層清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000 r/min離心3 min，除去苯酚。 （6） 小心吸出上清液轉(zhuǎn)入新的eppendorf管，用預(yù)冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30 min，然后13000 r/min離心15 min，可見白色絲狀沉淀物。 （7） 小心吸出液體，棄上清液，用預(yù)冷的400 μL 70％乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用100-200 μL DEPC水（含20 μg/mL的Rnase）溶解DNA。 裂解液（40 mM Tris-醋酸，20mM醋酸鈉,1 mM EDTA,1% SDS,pH 8.0）。 方法二：（1）將待檢測菌株接種于 3 mL LB 或 BHI 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜； 注： 以生長至對數(shù)期的細菌為最佳提取對象， 因為過對數(shù)期時培養(yǎng)基中會積聚過度的核酸酶 降解 DNA。 （2）取 1.5 mL 上述菌液于 2 mL 離心管，10,000~15,000 rpm，離心 10~15 min，去 上清（若所得菌體過少可重復(fù)此步驟一次） ； （3）加入 564 μL TE 緩沖液（pH 8.0）重懸菌體（可使用無菌牙簽充分混合菌體使其 完全重懸） 。 （4）加入 30 μL 10%~20% SDS 和 6 m 蛋白酶 μL（10 mg/mL） ，混合均勻、不得渦 旋，置于 37℃（可用金屬浴）條件反應(yīng) 1~2h，使懸液相對清澈有粘性為止。 （5） 加入 100 μL 5M NaCl， 混合均勻、 不得渦旋， 65℃反應(yīng) 2 min。 然后， 加入 80 μLCTAB/NaCl，混合均勻、不得渦旋， 65℃反應(yīng) 10 min。 注：在加入 CTAB/NaCl 之前,必須用 5M NaCl 充分混勻裂解產(chǎn)物，且 CTAB/NaCl 溶液加之 前得先預(yù)熱至 65℃，并且吸取時移液器槍頭應(yīng)去除尖端。 （6） 加入等體積 （約 800 μL 氯仿/異戊醇（24:1） 充分混勻， ， 10,000 rpm 離心 5 min。 離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 A）至新的 2 mL 離心管中。 （7）加入等體積（約 800 μL）酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）于上清液 A 中，充分混勻， 15,000 rpm 離心 5 min。離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 B） 至新的 2 mL 離心管中。 （8）加入等體積（約 800 μL）氯仿/異戊醇（24:1）于上清液 B 中，充分混勻，10,000 rpm 離心 5 min。離心后，轉(zhuǎn)移含有核酸的上清液（水相，即上清液 C）至新的 2 mL 離心管中。 加入用2倍體積無水乙醇沉淀DNA。 現(xiàn)在遇到的問題是當(dāng)加入SDS進行裂解的時候，總是做不到澄清，也不粘稠，兩個方法都是這樣（第一個方法本科畢設(shè)的時候用的很好，提出來的足夠用）。換成大腸桿菌，可以澄清粘稠。但是在加入苯酚/氯仿進行抽提的時候，抽提第二次就上下液層澄清程度讓人吃驚，中間也沒蛋白層了，后期根本沉淀不出DNA。感覺方法也沒有錯啊，怎么總是這個樣子，有沒有熟悉的，想請教一下。都提了接近兩周了。 |
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2樓2015-04-03 10:07:58
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4樓2015-07-26 17:24:52
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