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關(guān)于TOP10感受態(tài)細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆 已有7人參與
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最近在做重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆篩選，但是感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后涂平板，平板上都長(zhǎng)成菌苔，一大片都是大腸桿菌，已經(jīng)證明平板以及所使用的Ampcillin都可以正常使用，請(qǐng)各位蟲(chóng)友幫忙分析一下原因所在。 我的感受態(tài)細(xì)胞制備流程是這樣的: （1）從無(wú)Amp的LB平板上挑取單克隆菌體，打入3ml無(wú)Amp的LB液體培養(yǎng)液中，37℃，220rpm，振搖過(guò)夜； （2）取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1ml，加入100ml無(wú)Amp的LB中，220rpm，37℃培養(yǎng)約1h45min，分光光度計(jì)測(cè)OD600，OD600為0.4~0.5（實(shí)際測(cè)的時(shí)候已經(jīng)達(dá)到0.650）； （3）（此步開(kāi)始在冰上操作）用圓底50ml Tube收集菌液，5000rpm，4℃，離心5min，棄上清，每40~50ml培液加5ml Sol. A，輕輕混勻，5000rpm，繼續(xù)離心5min； （4）棄上清，加5ml Sol B，輕輕混勻置于冰上30min; （5）5000rpm，離心5min后棄上清，用15%甘油+85%SOL B混合液懸�。� （6）每管200μl分裝，保存于-80℃ 熱轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞： （1）從-80℃取出剛制備的TOP10感受態(tài)細(xì)胞200μl，置于冰上慢慢融化（約5min）； （3）取10μl連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30min； （4）42℃金屬浴熱激90s，放于冰上冰凍2~3min(此過(guò)程中可以將冰浴移至超凈臺(tái)中，進(jìn)行下一步準(zhǔn)備)； （5）加800μl無(wú)Amp的LB培養(yǎng)液，37℃，150rpm，搖床培養(yǎng)45min； （6）取200μl菌液，加入新的1.5mlEP管中，再加入200μl無(wú)Amp的LB培養(yǎng)基稀釋，輕輕吹打均勻后，全部加到Amp-LB平板上，涂布均勻。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。 平板在培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，平板上長(zhǎng)滿了菌落，形成菌苔，按理說(shuō)轉(zhuǎn)化效率不應(yīng)該這么高的，我的連接產(chǎn)物目的質(zhì)粒的濃度不到5ng/μl，所使用的Amp-LB平板沒(méi)有問(wèn)題（同實(shí)驗(yàn)室的師姐用的同一批倒的平板來(lái)做轉(zhuǎn)化，能成功），感受態(tài)細(xì)胞是當(dāng)天上午做好，晚上就用于轉(zhuǎn)化的，現(xiàn)在不知道問(wèn)題出在哪里，請(qǐng)蟲(chóng)友們幫忙分析分析，多謝了！ |
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