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jiangxizhongyao銅蟲(chóng) (初入文壇)
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冰凍切片和HE染色 已有17人參與
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近幾天做肝臟的病理形態(tài)學(xué)檢查，要做病理切片，找了相關(guān)資料，正好有空，就 發(fā)了這貼共看！該貼附件主要是說(shuō)明冰凍切片的方法（還是個(gè)改良的）和HE染色的主要步驟。 以下是學(xué)習(xí)簡(jiǎn)介，沒(méi)空別看。 我是一個(gè)學(xué)藥化的，老師的課題確是中藥，于是搞搞提取分離，當(dāng)我做到還沒(méi)到位時(shí)，就被趕來(lái)做藥理，于是盲目找資料，幸好碰到住一起的同學(xué)做藥理，給予了指點(diǎn)。但是，我做的藥理還涉及病理，所以又請(qǐng)教相關(guān)的同學(xué)－－－－－－－－－－－為什么不請(qǐng)教老師：因?yàn)橐郧皩W(xué)藥化沒(méi)想到認(rèn)識(shí)這不相干的人（希望蟲(chóng)民們多認(rèn)識(shí)人，別抱我這心態(tài)）------所以于是痛苦，可是問(wèn)題還是來(lái)了，暑假同學(xué)們很多都回家了。還得繼續(xù)想辦法，就象同學(xué)說(shuō)的，還得DIY�。�！  所以如果有高手，還請(qǐng)指點(diǎn)一下。 正文： 冰凍切片HE染色步驟 一、操作方法及步驟： ①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。 ②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 ③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。 ④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。 二、冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)： ①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過(guò)和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會(huì)破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 ②多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí)，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺(tái)上凍起來(lái)，然后依據(jù)不同的編號(hào)，依序切片，這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂。 ③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢(shì)來(lái)放置，所謂“砍柴看柴勢(shì)”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。 ④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭(zhēng)取時(shí)間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。 ⑤當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái)，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來(lái)軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。 ⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片，由于溫度相同，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)象。 三、冰凍切片的快速染色方法： ① 切片固定30秒－1分鐘。 ② 水洗。 ③ 染蘇木素3－5分鐘。 ④ 分化。 ⑤ 于堿水中返藍(lán)20秒。 ⑥ 伊紅染色10－20秒。 ⑦ 脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。 冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘�？偣苍�10分鐘內(nèi)完成快速制片過(guò)程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導(dǎo)體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導(dǎo)體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來(lái)說(shuō)已很少使用，因此在這里不作闡述。 常規(guī)方法： （1）冰凍切片固定 10～30 s （2）稍水洗 1～2 s （3）蘇木精液染色（60℃） 30～60 s （4）流水洗去蘇木精液 5～10 s （5）1%鹽酸乙醇 1～3 s （6）稍水洗 1～2 s （7）促藍(lán)液返藍(lán) 5～10 s （8）流水沖洗 15～30 s （9）0.5%曙紅液染色 30～60 s （10）蒸餾水稍洗 1～2 s （11）80%乙醇 1～2 s （12）95%乙醇 1～2 s （13）無(wú)水乙醇 1～2 s （14）石炭酸二甲苯 2～3 s （15）二甲苯（Ⅰ） 2～3 s （16）二甲苯（Ⅱ） 2～3 s （17）中性樹(shù)膠封固。 注：第（14）步如果不用石炭酸二甲苯，可改用無(wú)水乙醇，染色結(jié)果為：細(xì)胞核藍(lán)色、胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈深淺不一的紅色。 封片 切片染色后封片常用中性樹(shù)膠，酸性的樹(shù)膠可使胞核褪色，如樹(shù)膠放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因氧化而變酸。中性樹(shù)膠可用二甲苯稀釋。樹(shù)膠過(guò)濃，封片時(shí)容易導(dǎo)致氣泡；過(guò)稀，封片時(shí)易使膠外溢，影響美觀，也會(huì)出現(xiàn)由于二甲苯揮發(fā)后缺膠的現(xiàn)象。 在整個(gè)染色過(guò)程中不讓切片干涸：切片完全干涸，會(huì)使組織收縮和出現(xiàn)裂痕即出現(xiàn)所謂“龜裂”現(xiàn)象。也會(huì)使部分細(xì)胞核透明不良，看起來(lái)像黑色的細(xì)胞核，即形成“黑核”。 冰凍切片制作方法改進(jìn)探討 中華首席醫(yī)學(xué)網(wǎng) 2007年09月15日 05:59:39 Saturday 1119 作者：李建紅 石天峰 作者單位：長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院病理教研室（046000） 長(zhǎng)治衛(wèi)校 《長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2007年8月22卷4期 臨床醫(yī)學(xué) 【摘要】 目的：探討制片效果比較理想的冰凍切片制作方法，以提高冰凍切片的質(zhì)量。方法：擇取新鮮活體組織，取材后直接凍結(jié)，經(jīng)恒溫式冰凍切片機(jī)切片，冰凍固定液固定，HE染色。剩余組織做石蠟切片對(duì)照。結(jié)果：質(zhì)量較好，染色鮮艷，鏡下組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核漿對(duì)比分明。結(jié)論：此方法簡(jiǎn)便快速，制片質(zhì)量滿(mǎn)意，可提高病理診斷的準(zhǔn)確性。 【關(guān)鍵詞】 冰凍切片；制作；冰晶 冰凍切片的方法是一種最省時(shí)最快速的制片方法，因此主要用于臨床手術(shù)中的病理診斷。其原理是：冷凍使組織變硬以代替石蠟做浸蠟。將組織固定在標(biāo)本托上短時(shí)間內(nèi)凍好進(jìn)行切片。術(shù)中確診病變性質(zhì)，決定手術(shù)范圍，因此做出高質(zhì)量的冷凍切片至關(guān)重要。這就要求每個(gè)病理技術(shù)人員不僅要有高度的責(zé)任心，還要有熟練的技術(shù)，在最短時(shí)間內(nèi)制出高質(zhì)量的切片。我科在工作中，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)和不斷改進(jìn)，摸索出一種制片效果比較理想的冰凍切片制作法，在術(shù)中病理診斷取得滿(mǎn)意的效果，現(xiàn)介紹如下。 1 材料與方法 1.1 材料 2006年我科完成的冰凍切片140例其中涉及到的組織標(biāo)本有乳腺70例，卵巢55例，甲狀腺15例。采用德國(guó)萊卡恒溫式冷凍切片機(jī)。 1.2 方法 擇取新鮮活體組織取材后直接凍結(jié)、切片、即投入固定液（配制方法：40%福爾馬林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL）中，固定1 min～2 min，入蘇木素染核1 min～2 min，水洗后，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗后，0.1%氨水返藍(lán)，水洗后，入1%水溶性伊紅10 s左右，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封固。 2 結(jié)果 使用該方法所制冰凍切片速度明顯提高，切片質(zhì)量較好，染色鮮艷，鏡下組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核，細(xì)胞漿色彩鮮艷對(duì)比分明，術(shù)后診斷符合率達(dá)96%以上。 3 討論 病理技術(shù)是病理學(xué)診斷不可分割的一部分，制片質(zhì)量的好壞很大程度上影響病理醫(yī)生做出正確的病理診斷。因此，保證和提高制片質(zhì)量是每個(gè)病理技術(shù)員的責(zé)任。為了保證制片質(zhì)量，減少差錯(cuò)，防范責(zé)任事故，避免醫(yī)療糾紛，有必要加強(qiáng)對(duì)病理技術(shù)進(jìn)行科學(xué)規(guī)范管理和制片的控制。在冰凍切片方面我科主要從以下環(huán)節(jié)上加強(qiáng)質(zhì)控。 3.1 組織取材大小 組織塊大小適宜，理想取材大小為1.5 cm×1.5 cm，厚2 mm。組織過(guò)大，切片時(shí)阻力過(guò)大，易產(chǎn)生皺折，刀痕，組織易崩碎，增加制片難度，影響診斷。如需在同一標(biāo)本托上放大小兩塊組織時(shí)，應(yīng)盡量?jī)龀梢粋�(gè)平面，與刀鋒平齊，以防切片不完整，發(fā)生漏診。若送檢組織過(guò)小，請(qǐng)預(yù)先速凍一冷臺(tái)面，再行包埋，利于制片。 3.2 冷凍時(shí)間 速凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切片呈碎屑或條痕狀，其處理方法是：切出完整平面后用戴乳膠手套的拇指按壓回溫，直到切片完整為止，反之，時(shí)間過(guò)短，切片呈粥糜狀或切不下來(lái)，則需繼續(xù)冷凍。 3.3 切片 切片時(shí)用力均勻，厚度約4 μm～5 μm，特殊要求時(shí)可達(dá)3 μm，切好的組織在干凈的玻片上粘附時(shí)可順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶，可避免組織攤片過(guò)程中皺折，切好后立即放入提前配制好的冰凍切片固定液中及時(shí)固定1 min～2 min［１］。 3.4 染色 切片后做快速HE染色,蘇木素染色過(guò)程需加熱進(jìn)行,一般1 min～2 min即可。這樣做出來(lái)的快速切片鏡下觀結(jié)構(gòu)完整、平坦、無(wú)皺折。細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色色澤鮮艷,對(duì)比清晰,細(xì)胞無(wú)腫脹,無(wú)收縮,近似常規(guī)石蠟切片,封片時(shí)注意無(wú)氣泡及無(wú)溢液,切片整潔,標(biāo)簽清楚端正,根據(jù)需要可切出半張玻璃片大小,厚薄均勻,一層細(xì)胞的組織切片［２］。 3.5 冰晶的形成致使無(wú)法及時(shí)準(zhǔn)確地為臨床提供病理診斷依據(jù)。我們知道，生物體是由細(xì)胞構(gòu)成的，一般情況下，細(xì)胞中水分約占80%～90%，水在各種組織中含量最多，其解決方法為：①在不影響病理診斷的前提下，標(biāo)本取材盡量小一些，組織厚度勿超過(guò)4 mm，這樣有利于組織的快速凍結(jié)，將組織塊快速移到冷凍頭上驟冷以縮短冷凍時(shí)間,減少冰晶現(xiàn)象出現(xiàn),有效防止冰晶擠壓周?chē)M織，改變甚至破壞組織原來(lái)的形態(tài)結(jié)構(gòu)［３］。②臨床科室若術(shù)中需要冰凍，應(yīng)通知病理科，以便提前開(kāi)機(jī)做好準(zhǔn)備，這樣可避免由于緩慢冷凍所產(chǎn)生的冰晶。因?yàn)槔鋮s速度愈快，過(guò)冷溫度越低，所形成的晶核數(shù)量越多，晶體來(lái)不及生長(zhǎng)就被凍結(jié)，從而失去了形成較大冰晶的機(jī)會(huì)。③需要術(shù)中進(jìn)行快速病理診斷的活檢組織，最好用一次性塑料或乳膠手套盛放，切忌用紗布包裹組織，以免紗布上的線毛粘在組織上，不利于制片，且易損傷刀刃。④臨床醫(yī)師送檢標(biāo)本盡量避開(kāi)水源不要用生理鹽水浸泡或用濕紗布包裹組織，由于液體浸泡后，組織內(nèi)水分會(huì)增加，易造成冷凍后組織內(nèi)冰晶形成增多。組織送檢取材時(shí)，如遇含水量高的標(biāo)本時(shí)，應(yīng)盡量用干紗布吸干水分后再行冷凍，避免由于冰晶形成出現(xiàn)診斷上的失誤。 對(duì)于冰凍切片的質(zhì)量因素主要有以上幾點(diǎn)，固然還存在某些其他方面的因素。如果能正確對(duì)待以上幾方面的問(wèn)題，冰凍切片的質(zhì)量方可得到保證，且能制備出一張質(zhì)量?jī)?yōu)秀的切片，為明確病理診斷提供較為便利的客觀條件。 【參考文獻(xiàn)】 �。郏保� 駱新蘭.冰凍切片常見(jiàn)問(wèn)題探討［Ｊ］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)，1999,15(4):273. �。郏玻� 列增輝.病理染色技術(shù)［Ｊ］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000：35. �。郏常� 田玉旺,丁華野．一種減少冷凍切片組織內(nèi)冰晶的處理方法［Ｊ］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2002,18(5):568. [search]藥理 冰凍 切片 HE 染色[/search] [ Last edited by jiangxizhongyao on 2008-7-3 at 21:45 ] |
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