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[求助] 做的TA克隆，一直連不上已有5人參與

最近在做TA克隆，用的全式金的PMD19-T載體，我的目的基因片段為300bp左右，濃度為30ng/ul，體系為 DNA 4.5ul，solutionI 5ul，PMD19-t 0.5ul，16℃過(guò)夜，用的感受態(tài)為T(mén)rans1-t1，菌落PCR，沒(méi)有見(jiàn)到我的目的條帶，已經(jīng)挑取10多個(gè)菌落了，都沒(méi)有，這是為什么？

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【求助/交流】分類(lèi)鑒定的時(shí)候，為什么pcr之后還要做TA克隆，轉(zhuǎn)化，然后將序列測(cè)序呢？已經(jīng)有5人回復(fù)

1樓 2015-04-23 16:08:12

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同學(xué)，你用的產(chǎn)品、體系都沒(méi)問(wèn)題，我一直有做，和你用的試劑也一樣。
給你點(diǎn)建議你參考一下：自己的DNA濃度或者質(zhì)量提高一下（重新PCR，多做幾管濃縮等），PMD-19T加至0.8微升。

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2樓2015-04-23 16:48:50

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2樓: Originally posted by 墨爾本機(jī)器 at 2015-04-23 16:48:50
同學(xué)，你用的產(chǎn)品、體系都沒(méi)問(wèn)題，我一直有做，和你用的試劑也一樣。
給你點(diǎn)建議你參考一下：自己的DNA濃度或者質(zhì)量提高一下（重新PCR，多做幾管濃縮等），PMD-19T加至0.8微升。

那DNA加多少？你的DNA濃度是多少？

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3樓2015-04-26 16:20:18

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3樓: Originally posted by NSDSKY_LZM at 2015-04-26 16:20:18
那DNA加多少？你的DNA濃度是多少？...

DNA4.5微，濃度80的，鏈接是高一點(diǎn)成功率高

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4樓2015-04-26 17:14:03

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NSDSKY_LZM(西門(mén)吹雪170代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-04-29 18:46:04

你的條帶確定是單一的么？如果是條帶不亮或者你切膠的時(shí)候切了其他的大小近似條帶就肯定連不上。

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5樓2015-04-26 17:38:24

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5樓: Originally posted by sx65781915 at 2015-04-26 17:38:24
你的條帶確定是單一的么？如果是條帶不亮或者你切膠的時(shí)候切了其他的大小近似條帶就肯定連不上。

條帶是單一的

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6樓2015-04-26 18:56:37

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4樓: Originally posted by 墨爾本機(jī)器 at 2015-04-26 17:14:03
DNA4.5微，濃度80的，鏈接是高一點(diǎn)成功率高...

載體提高到0.8uL，DNA4.5uL，solutionI是4.7uL嗎？

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7樓2015-04-26 18:58:33

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7樓: Originally posted by NSDSKY_LZM at 2015-04-26 18:58:33
載體提高到0.8uL，DNA4.5uL，solutionI是4.7uL嗎？...

2X的，當(dāng)然是5微升了，這只是我一直用的體系，還挺順利的。如果插入片段大于1000bp，我會(huì)用1微升以上的載體，另兩個(gè)組份不變。

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8樓2015-04-26 19:50:08

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8樓: Originally posted by 墨爾本機(jī)器 at 2015-04-26 19:50:08
2X的，當(dāng)然是5微升了，這只是我一直用的體系，還挺順利的。如果插入片段大于1000bp，我會(huì)用1微升以上的載體，另兩個(gè)組份不變。...

請(qǐng)問(wèn)一下我一直都是這樣做的，但是有個(gè)問(wèn)題，每次連接轉(zhuǎn)化之后，涂平板，1小時(shí)后藍(lán)白斑篩選的時(shí)候總是沒(méi)有藍(lán)的這是為啥？還有挑菌后，用氨芐培養(yǎng)基搖菌，為什么我的菌液老是沉在底部，都不是渾濁的，而且量很難變多，能不能上傳一張涂平板后的圖片給我看看是著么樣的，謝謝

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9樓2015-04-26 21:15:39

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你用的什么酶做PCR

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10樓2015-04-27 14:42:18

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