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博克儂浮碼銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
克隆載體連接不上 已有1人參與
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| 最近做克隆，目的片段1700bp,載體10.4k,分別單酶切后連接一直連接不上，不知道哪里出了問題，單酶切完全，就是膠回收率不高，用的QIAEXII試劑盒回收的載體，回收的濃度不高，才10ng/ul, 聽說用醇濃縮可以提高濃度，不知道單酶切后可以直接醇濃縮載體嗎，如果可以，具體步驟是什么，做了三個(gè)多月了，一直連接不上，請(qǐng)前輩們支支招。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
博克儂浮碼(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-22 20:40:11
博克儂浮碼: 金幣+6, ★★★★★最佳答案 2014-07-25 22:13:22
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博克儂浮碼: 金幣+6, ★★★★★最佳答案 2014-07-25 22:13:22
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1. 10ng/ul的確太少了，試著加大酶切載體量。單酶切回收沒有必要用切膠回收，用一般的DNA回收試劑盒（洗脫柱）就沒問題。也要考慮DNA洗脫柱的所能回收片段的最大值，確定你的載體大小沒有超過上限 2.樓主說單酶切，是指你的目的片段和載體的兩端都是同一位點(diǎn)對(duì)吧？比如片段是EcoRI-insert-EcoRI，然后載體單切后線性成EcoRI-vector-EcoRI。如果是這樣的話，最好將你的載體做一下去磷酸化。用磷酸酶Alkaline Phosphatase處理一下（37° 1h），然后再回收。有些AP是可以直接在內(nèi)切酶Buffer使用的，尤其是內(nèi)切酶和AP是同一個(gè)公司的話。這樣你就可以酶切后直接加AP，然后再回收，少一次損耗 注：只用AP處理你的載體，不要處理目的片段。粘性末端的連接是需要磷酸基的，用AP除去磷酸基團(tuán)是為了防止你的質(zhì)粒重新自連。如果不用AP處理，你加入連接酶后載體會(huì)重新自連，片段無法插入。但是如果你用AP把片段也處理的話，就沒有磷酸基用了，所以只用處理質(zhì)粒就行。 3. 注意目的片段和載體的數(shù)量比，一般是3:1-5:1.如果連接困難，可以試著加大目的片段量。 |
2樓2014-07-22 19:01:34
博克儂浮碼
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2014-07-23 15:19:04
4樓2014-07-24 21:58:46
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 15:12:15
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-26 15:12:15
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其實(shí)你先不用換試劑盒，可以試試直接用你切膠的試劑盒，但是不要跑膠就行了。理論上來講，從溶液回收和從膠回收除了第一步以外都是一樣的�；厥杖芤旱腷uffer不一定能回收膠，但是回收膠的應(yīng)該可以回收溶液。切膠回收第一步一般應(yīng)該是加Buffer然后水浴溶膠吧？你可以在你的酶切混合液中直接加那個(gè)buffer，然后就按照那個(gè)洗脫流程走下來。試試看能不能回收DNA，我覺得應(yīng)該是沒問題的。 |
5樓2014-07-25 02:18:45
楊仔
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6樓2014-07-25 16:00:16
博克儂浮碼
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7樓2014-07-25 22:13:07
8樓2014-07-29 15:50:14
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