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[求助]
求助關(guān)于制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)的經(jīng)驗 已有1人參與
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通過查資料和瀏覽小木蟲，得到了幾種制備枯草感受態(tài)的方法，但實驗了若干次總是失敗，還經(jīng)常出現(xiàn)感受態(tài)污染，甚至沒有轉(zhuǎn)化的對照組也能長出菌來。 我所用的抗生素是紅霉素，因為一直沒有好的效果，所以一直在做濃度梯度：0.4、4、5、6、7、8、10μg/ml。 以下是我所用的各種方法： 一、1、菌種在斜面培養(yǎng)2天，孢子形成率接近100%。 2、接于5ml GMⅠ溶液，在30℃慢搖床（100rpm）振蕩培養(yǎng)過夜。 3、次日取2ml轉(zhuǎn)接到18ml GMⅠ中，37℃快搖床（200rpm）培養(yǎng)3.5小時。 4、再取10ml轉(zhuǎn)接到90ml GMⅡ中，37℃慢搖床培養(yǎng)90分鐘，離心收集菌體。 5、用10ml上清液懸浮菌體，并加30%的滅菌甘油至10%，混勻后分裝到離心管中（0.5ml/Tube），隨即放到-70℃保存。 6、轉(zhuǎn)化時取出離心管，放在45℃水浴中溶化，然后在0.5ml菌液中加入適量DNA（1ug/ml）。 7、于37℃緩慢振蕩（80rpm）保溫30分鐘后涂抗性平板，再在37℃培養(yǎng)過夜，次日檢查轉(zhuǎn)化子。 【培養(yǎng)基配方】 1.10×最低鹽溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4.3H2O 18.34g），KH2PO4 6g，(NH4)2SO4 2g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7.2H2O）1g，MgSO4.7H2O 0.2g，在蒸餾水中依 次溶解，加水至100ml。 2.L- trp溶液，2mg/ml，貯于棕色瓶內(nèi)，113℃滅菌30min，用黑紙包裹。 3.GMⅠ溶液：1×最低鹽溶液95ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，2mg/ml L- trp 2.5ml（50ug/ml）。 4.GMⅡ溶液：1×最低鹽溶液97.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母汁0.04ml，0.5M MgCl2 0.5ml(2.5mM)，0.1M CaCl2 0.5ml(0.5mM)，2mg/ml L- trp 0.5ml（5ug/ml）。 于37℃緩慢振蕩（80rpm）保溫30分鐘后涂抗性平板，再在37℃培養(yǎng)過夜，次日檢查轉(zhuǎn)化子。 ★ ”次日取2ml轉(zhuǎn)接到18ml GMⅠ中，37℃快搖床（200rpm）培養(yǎng)3.5小時“，我看有人說這一步大概養(yǎng)到OD600為0.85-0.95，但是我做的大概在2.5小時的時候就已經(jīng)OD600為1.28了。整個人就凌亂了。這種比較籠統(tǒng)的表述對于我這種新手來說真心是個挑戰(zhàn)，有沒有哪位大神知道具體的信息？ 二、1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過夜。 3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長末期(168 約4-5 h)。 4. 取0.2 ml 生長至對數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。 5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。 6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能過高，不超過5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。 【培養(yǎng)基配方】 1. SP 鹽：0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE (100×)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培養(yǎng)基：SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養(yǎng)基：SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml)：0.4% (NH4)2SO4 ：2 g 2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g 1.2% KH2PO4 ：6 g 0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g 121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml)：0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g 121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml)：2% Casamino acid ：2 g 10% Yeast Extract：10 g 121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL)： SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v，115°C滅菌20 min) ：200 μL (1%V)100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium(6 mL)：SPI Medium：5.88mL (1%V)50mM CaCl2 ：60μL (1%V)250mM MgCl2：60μL 11. 100×EGTA Solution：10mmol/L EGTA 溶液，溶解時需加少量NaOH 至pH8.0。 三、① 取凍存的B.subtilis 一環(huán)，在LB 平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜活化。 ② 挑取單菌落接種于5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)（18h）。 ③ 取一定量的過夜培養(yǎng)物到4.5ml的Medium A 中，使OD650 值到達(dá)0.1-0.2，留下4.5ml 混合菌液。 ④ 37℃ 200rpm 振蕩培養(yǎng)，每個20min 測一次OD650，當(dāng)OD650 到達(dá)0.4-0.6（大約需要60-90min）時記時為t0。 ⑤ 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)90min，計時為t90，吸取0.05ml 菌液至存有0.45ml 預(yù)熱的Medium B 的無菌試管中； ⑥ 37℃振蕩90min，此時培養(yǎng)物中有很多感受態(tài)細(xì)胞形成； ⑦ 加1μg 的質(zhì)粒（15-20ul），37℃振蕩培養(yǎng)30min。 ⑧ 離心去除大部分的上清液，重懸細(xì)胞，涂在含有相應(yīng)抗生素的篩選平板上，37℃培養(yǎng)過夜 ★ 這種方法我是從第4步開始每隔20min就測OD650，一直到基本穩(wěn)定了，換成對數(shù)值后選取對數(shù)期生長率的拐點作為t0，90min后也差不多就是對數(shù)末期了，但這種方法因為需要一直測吸光度，所以我的感受態(tài)經(jīng)常污染，而且也沒有轉(zhuǎn)化成功。 基本就是這三種方法了，因為我們實驗室沒有做過枯草的系統(tǒng)，所以很多都是我自己摸索的，比較笨，各位大神不喜勿噴。 我想肯定是有些關(guān)鍵點我沒有Get到，一直陷在沼澤之中無法自拔。 望各位大神能傾囊相助，提供一些你們成功的經(jīng)驗，為小女子指點迷津，我將不勝感激！ |
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4樓2015-05-10 09:05:51
2樓2015-05-10 08:30:52
3樓2015-05-10 08:58:15
liygmail
至尊木蟲 (職業(yè)作家)
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楊柳依依625: 金幣+10, ★有幫助 2015-05-12 14:14:42
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枯草芽孢桿菌營養(yǎng)遞減兩步法，一般步驟： 首先，菌體在豐富培養(yǎng)基上生長到對數(shù)期末或穩(wěn)定期初期（可定期檢測OD)，轉(zhuǎn)接貧乏培養(yǎng)基，生長至對數(shù)期末或穩(wěn)定期初期（可定期檢測OD)，此時感受態(tài)效果最好。個人理解，實驗環(huán)節(jié)中，某些protocol的操作參數(shù)（例如培養(yǎng)幾小時或90min），對于不同的具體培養(yǎng)條件以及不同菌株，具體參數(shù)應(yīng)有所差異，不宜機(jī)械照搬。 ps：陰性對照抗性平板上也長，只能說明兩點：一、操作有污染，二、抗生素失效了 |
5樓2015-05-10 11:11:25
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