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demiiiii新蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于引物設(shè)計的問題 已有5人參與
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純小白被分子實驗老師要求自己設(shè)計引物， 但是我們加上酶切位點和保護堿基之后Tm有70多度，這個引物還需不需要改啊？ F: 5’ cgg gat ccc ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI R: 5’ cgg aat tcc gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
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demiiiii: 金幣+5, ★★★★★最佳答案, 回答很全面，對我這個小白來說很有幫助 2015-05-17 16:00:03
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總體來說感覺很不錯啊，但是 1，引物當(dāng)中應(yīng)該是不小心復(fù)制了兩次酶切位點和保護堿基吧？猜測你設(shè)計的引物是下面的序列： F: 5’ c ggg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 3’ BamHI R: 5’ c gga att cct tgt aca gct cgt cca tgc 3’ EcoRI 2， F引物的二級結(jié)構(gòu)可能有點復(fù)雜。可以修改保護堿基成cgc。 cgc gg atc cat ggc agg tta ccc ata cgac 也可以根據(jù)目的片斷的序列修改保護堿基。對于這兩個酶，一般兩到三個堿基都可以，三個更好。 3，兩個引物的退火溫度差別不大，這個很好。因為加了保護堿基和酶切位點，所以退火溫度比較高。但是第一次PCR的時候只有后面的序列可以退火，溫度在65-67，所以應(yīng)該沒問題的。有沒有雜帶只能做了PCR才能知道。 4，再比對下序列。 |
2樓2015-05-15 19:33:48
zhangyunjing
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6樓2015-05-16 10:05:28
demiiiii
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4樓2015-05-15 22:59:21
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5樓2015-05-16 09:41:17
cry_2013
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10樓2015-05-17 16:09:13
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