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ruan123456金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
抗體親和力測(cè)定
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請(qǐng)問(wèn)我實(shí)驗(yàn)遇到下面這種情況應(yīng)該怎么辦呢？請(qǐng)分析原因并提出解決方案。O(∩_∩)O謝謝！ 1，方法：抗體竟?fàn)幗Y(jié)合抗原（ELISA） 2，抗原：200kd，從1000ng/ml倍比稀釋（1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625,0） 3，細(xì)胞上清（間接ELISA檢測(cè)：OD值達(dá)到2.4）：原液，稀釋500倍，1000倍，2000倍，4000 4，過(guò)程：0.5μg/ml抗原包被（100μl/孔），4℃過(guò)夜，1%BSA封閉（200μl/孔，37℃,2h），酶標(biāo)板經(jīng)驗(yàn)證：陽(yáng)性正常，陰性正常。細(xì)胞上清稀釋液和抗原梯度稀釋液各60μl混合于細(xì)胞培養(yǎng)板中，4℃過(guò)夜；吸取100μl/孔加入到抗原包被的板條中，37℃,1h后，將酶標(biāo)板中的混合液轉(zhuǎn)到另一塊相同酶標(biāo)板中，作為平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP標(biāo)記二抗，37℃，30min;洗板，顯色。結(jié)果：細(xì)胞上清原液OD值均在2.0以上，變化無(wú)規(guī)律，500倍及更高倍稀釋液幾乎不顯色；平衡板結(jié)果與原板基本無(wú)差別。平行試驗(yàn)：細(xì)胞上清稀釋液和抗原梯度稀釋液各60μl混合于抗原包被板中（酶標(biāo)板），37℃,1h后，將酶標(biāo)板中的混合液轉(zhuǎn)到另一塊相同酶標(biāo)板中，作為平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP標(biāo)記二抗，37℃，30min;洗板，顯色。結(jié)果：細(xì)胞上清原液OD值均在2.0以上，變化無(wú)規(guī)律，500倍及更高倍稀釋液幾乎不顯色；平衡板結(jié)果與原板基本無(wú)差別。重復(fù)以上步驟，結(jié)果無(wú)變化。 |
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ruan123456
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ruan123456: 回帖置頂 2015-07-01 15:39:21
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第一點(diǎn)：變量問(wèn)題，這個(gè)實(shí)驗(yàn)室只有一個(gè)變量的，在抗原濃度一定時(shí)，比如抗原濃度1000時(shí)，抗體濃度在原液，稀釋500倍，1000倍，2000倍，4000倍之間變化；同理，抗體濃度一定時(shí)，抗原濃度在變。 第二點(diǎn)：實(shí)際上這個(gè)實(shí)驗(yàn)只有抗原濃度時(shí)變量，抗體濃度濃度的變化是一個(gè)探討實(shí)驗(yàn)。 第三點(diǎn)：抗原分子量太大，指的是多大，我看到有資料在150KD時(shí)檢測(cè)正常，我的抗原是200KD，差距應(yīng)該不會(huì)太大。 第四點(diǎn)：這是單抗，多抗應(yīng)該沒(méi)有細(xì)胞上清吧？ 謝謝！ |
3樓2015-07-01 15:36:07
緋紅誓言
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ruan123456: 金幣+50, ★★★很有幫助 2015-07-01 15:37:21
ruan123456: 金幣+50, ★★★很有幫助 2015-07-01 15:37:21
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首先，比較抗體親和力，簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單測(cè)個(gè)效價(jià)就ok了！ 其次就你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有幾點(diǎn)要說(shuō)的： 1.你用競(jìng)爭(zhēng)首先要保證競(jìng)爭(zhēng)物和抗體只有一個(gè)是變量，才能看出競(jìng)爭(zhēng)趨勢(shì)（你的同一個(gè)實(shí)驗(yàn)抗原與上清都是變量） 2.做競(jìng)爭(zhēng)時(shí)競(jìng)爭(zhēng)物濃度需要一定的摸索(不要期望一個(gè)實(shí)驗(yàn)就完事），最好對(duì)結(jié)果有目標(biāo)--最低檢出限，不能說(shuō)競(jìng)爭(zhēng)物特別多有競(jìng)爭(zhēng)，那么抗體也沒(méi)用。 3.抗原分子量太大不建議做競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)有空間位阻，呈現(xiàn)假陽(yáng)性。 4.不知道你這個(gè)抗體是單抗還是多抗，多抗做競(jìng)爭(zhēng)不如單抗，位點(diǎn)太多。 |
2樓2015-06-29 22:22:18
緋紅誓言
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2015-07-03 13:04:27, 11.46 K
4樓2015-07-03 13:05:31
ruan123456
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5樓2015-07-21 16:23:21
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