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ruan123456金蟲 (小有名氣)
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[求助]
抗體親和力測定
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請問我實驗遇到下面這種情況應(yīng)該怎么辦呢？請分析原因并提出解決方案。O(∩_∩)O謝謝！ 1，方法：抗體竟?fàn)幗Y(jié)合抗原（ELISA） 2，抗原：200kd，從1000ng/ml倍比稀釋（1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625,0） 3，細(xì)胞上清（間接ELISA檢測：OD值達(dá)到2.4）：原液，稀釋500倍，1000倍，2000倍，4000 4，過程：0.5μg/ml抗原包被（100μl/孔），4℃過夜，1%BSA封閉（200μl/孔，37℃,2h），酶標(biāo)板經(jīng)驗證：陽性正常，陰性正常。細(xì)胞上清稀釋液和抗原梯度稀釋液各60μl混合于細(xì)胞培養(yǎng)板中，4℃過夜；吸取100μl/孔加入到抗原包被的板條中，37℃,1h后，將酶標(biāo)板中的混合液轉(zhuǎn)到另一塊相同酶標(biāo)板中，作為平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP標(biāo)記二抗，37℃，30min;洗板，顯色。結(jié)果：細(xì)胞上清原液OD值均在2.0以上，變化無規(guī)律，500倍及更高倍稀釋液幾乎不顯色；平衡板結(jié)果與原板基本無差別。平行試驗：細(xì)胞上清稀釋液和抗原梯度稀釋液各60μl混合于抗原包被板中（酶標(biāo)板），37℃,1h后，將酶標(biāo)板中的混合液轉(zhuǎn)到另一塊相同酶標(biāo)板中，作為平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP標(biāo)記二抗，37℃，30min;洗板，顯色。結(jié)果：細(xì)胞上清原液OD值均在2.0以上，變化無規(guī)律，500倍及更高倍稀釋液幾乎不顯色；平衡板結(jié)果與原板基本無差別。重復(fù)以上步驟，結(jié)果無變化。 |
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ruan123456
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3樓2015-07-01 15:36:07
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ruan123456: 金幣+50, ★★★很有幫助 2015-07-01 15:37:21
ruan123456: 金幣+50, ★★★很有幫助 2015-07-01 15:37:21
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首先，比較抗體親和力，簡簡單單測個效價就ok了！ 其次就你的實驗設(shè)計有幾點要說的： 1.你用競爭首先要保證競爭物和抗體只有一個是變量，才能看出競爭趨勢（你的同一個實驗抗原與上清都是變量） 2.做競爭時競爭物濃度需要一定的摸索(不要期望一個實驗就完事），最好對結(jié)果有目標(biāo)--最低檢出限，不能說競爭物特別多有競爭，那么抗體也沒用。 3.抗原分子量太大不建議做競爭，會有空間位阻，呈現(xiàn)假陽性。 4.不知道你這個抗體是單抗還是多抗，多抗做競爭不如單抗，位點太多。 |
2樓2015-06-29 22:22:18
緋紅誓言
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2015-07-03 13:04:27, 11.46 K
4樓2015-07-03 13:05:31
ruan123456
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