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肉肉-rourou

鐵蟲(chóng) (初入文壇)

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[交流] pcr 不出目的條帶已有4人參與

半個(gè)月前設(shè)計(jì)的引物，用DNA跑出條帶后，送去測(cè)序，與設(shè)計(jì)的相吻合�？墒亲罱躊CR，只有質(zhì)粒出，DNA一個(gè)條帶都不出，不知道什么原因，是需要改變體系么？怎么改體系呢？新手，謝謝啦！用過(guò)兩個(gè)體系嘗試，如下：
反應(yīng)體系：20                體系2：20
dNTP  0.5                   dNTP 0.4
Buffer  0.5                   Buffer  2
ddH2O  13.5                ddH2O  10.4
上游引物  2                上游引物：1.5
下游引物  2                下游引物：1.5
DNA  1                         DNA 4

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PCR大量擴(kuò)增不出目的條帶已經(jīng)有3人回復(fù)

1樓 2015-07-17 13:58:04

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18761615793

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

小蟲(chóng)

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排除了模板問(wèn)題，引物也需要驗(yàn)證，此外注意優(yōu)化體系，摸索退火溫度吧，具體操作還是看自己，可以產(chǎn)生熱啟動(dòng)PCR酶擴(kuò)增，高保真taq聚合酶類(lèi)的熱啟動(dòng)形式也可以采用，擴(kuò)增效果很好

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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful

8樓2015-07-27 17:07:41

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great07225388

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西門(mén)吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-07-17 22:58:08

是以前跑pcr能出結(jié)果，現(xiàn)在跑，出不來(lái)了嗎？如果是，模板可能降解了，建議下次把模板跑個(gè)膠看看有沒(méi)有降解�；蛘呤裁礀|西加錯(cuò)了，或者上下游引物忘了加其中的一個(gè)，等等。先排除主觀原因，再排除客觀原因。祝實(shí)驗(yàn)順利！

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2樓2015-07-17 17:09:53

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沒(méi)想好名字

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話(huà)說(shuō)你的酶呢？dntp和buffer各2ul，引物1ul，模板你就要做個(gè)梯度試一下了

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3樓2015-07-19 09:04:11

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引用回帖:

3樓: Originally posted by 沒(méi)想好名字 at 2015-07-19 09:04:11
話(huà)說(shuō)你的酶呢？dntp和buffer各2ul，引物1ul，模板你就要做個(gè)梯度試一下了

酶忘記寫(xiě)了。。。之前跑出來(lái)的模板不可以直接用么？

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4樓2015-07-20 14:05:52

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