冰凝草

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[求助] 不知道為什么用豬的腸道的cDNA 一直都無法PCR出目的條帶

最近一直在努力從豬的腸道的cDNA 中PCR出目的條帶，是APN這個基因的條帶，一開始的時候是使用的DNA，但是由于設(shè)計的引物是以mRNA為依據(jù)的，所以后來開始換用RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，目的條帶不是很大，只有3Kb左右，是一開始設(shè)計的全長的引物，但是沒有結(jié)果，所以設(shè)計了兩段只有500bp 大小的引物，都成功的PCR出目的條帶了，鑒定也是對的，所以就又重新設(shè)計兩段1.5Kb 的引物，為了做重疊PCR，但是還是沒有結(jié)果。
最后設(shè)計的引物的上下游的Tm值相差較大，但是試了48、53、55、57、59之后都是沒有條帶，不知道是什么原因呢？

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1樓 2012-12-29 22:25:54

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yixuanwin

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

你怎么知道反轉(zhuǎn)錄以后有沒有剪切。

說不定你的后來1。5kb的就剪切掉了一部分呢。

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2樓2012-12-30 14:53:28

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joan198108

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冰凝草: 金幣+1, ★有幫助, 嗯，可是我已經(jīng)設(shè)計了三次引物了，真核生物好像都挺難做的 2012-12-31 17:09:14

引物、退火溫度、酶以及退火變性時間可能都會影響實驗結(jié)果。我最近在用寶生物的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 酶，感覺不錯。直接設(shè)置退火以及延伸兩步，并且延伸速度也快。我的經(jīng)驗是，如果該酶擴增不成功，最好就是重新設(shè)計引物。建議樓主試一下。

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3樓2012-12-31 10:07:29

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冰凝草

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引用回帖:

2樓: Originally posted by yixuanwin at 2012-12-30 14:53:28
你怎么知道反轉(zhuǎn)錄以后有沒有剪切。

說不定你的后來1。5kb的就剪切掉了一部分呢。

是說cDNA不完整么？我也是考慮到了這一點，準備重新提RNA再反轉(zhuǎn)錄一次

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4樓2012-12-31 17:10:05

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lihegang2000

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

退火溫度可以適當提高一下

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5樓2012-12-31 19:00:13

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wizardfan: 金幣+1, 謝謝反饋 2013-01-04 06:57:26

引用回帖:

5樓: Originally posted by lihegang2000 at 2012-12-31 19:00:13
退火溫度可以適當提高一下

我從48度到63度都試過了，但還是沒有結(jié)果

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6樓2013-01-03 20:09:34

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lihegang2000

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★ ★
冰凝草: 金幣+2, ★有幫助, 退貨溫度那么高可以么，我從來沒用過63以上的高溫。GC含量是挺高的，但是已經(jīng)添加了DMSO了呢，片段也不算很大，可是500多的小片段可以P出來，但是大段就不行 2013-01-04 15:16:29

引用回帖:

6樓: Originally posted by 冰凝草 at 2013-01-03 20:09:34
我從48度到63度都試過了，但還是沒有結(jié)果...

1、退火溫度可以提高到70度
2、GC含量高的話，要用GC buffer
3、實在不行，可以分兩段擴增，然后拼起來

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7樓2013-01-04 08:23:01

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