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冰凝草木蟲 (小有名氣)
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[求助]
不知道為什么用豬的腸道的cDNA 一直都無法PCR出目的條帶
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最近一直在努力從豬的腸道的cDNA 中PCR出目的條帶，是APN這個(gè)基因的條帶，一開始的時(shí)候是使用的DNA，但是由于設(shè)計(jì)的引物是以mRNA為依據(jù)的，所以后來開始換用RNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA，目的條帶不是很大，只有3Kb左右，是一開始設(shè)計(jì)的全長的引物，但是沒有結(jié)果，所以設(shè)計(jì)了兩段只有500bp 大小的引物，都成功的PCR出目的條帶了，鑒定也是對(duì)的，所以就又重新設(shè)計(jì)兩段1.5Kb 的引物，為了做重疊PCR，但是還是沒有結(jié)果。 最后設(shè)計(jì)的引物的上下游的Tm值相差較大，但是試了48、53、55、57、59之后都是沒有條帶，不知道是什么原因呢？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
冰凝草: 金幣+1, ★有幫助, 嗯，可是我已經(jīng)設(shè)計(jì)了三次引物了，真核生物好像都挺難做的 2012-12-31 17:09:14
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冰凝草: 金幣+1, ★有幫助, 嗯，可是我已經(jīng)設(shè)計(jì)了三次引物了，真核生物好像都挺難做的 2012-12-31 17:09:14
| 引物、退火溫度、酶以及退火變性時(shí)間可能都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我最近在用寶生物的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 酶，感覺不錯(cuò)。直接設(shè)置退火以及延伸兩步，并且延伸速度也快。我的經(jīng)驗(yàn)是，如果該酶擴(kuò)增不成功，最好就是重新設(shè)計(jì)引物。建議樓主試一下。 |
3樓2012-12-31 10:07:29
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4樓2012-12-31 17:10:05
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5樓2012-12-31 19:00:13
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6樓2013-01-03 20:09:34
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7樓2013-01-04 08:23:01
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