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再鬧不給糖新蟲 (正式寫手)
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[求助]
RT-PCR引物設(shè)計求助 已有2人參與
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我設(shè)計過兩次RT-PCR引物，第一次用的是primer premier 5.0 設(shè)計的引物，用的軟件自帶的搜索引物功能，然后參照Tm，GC含量（選取45%-60%之間Tm值相近的作為引物）以及還有dimer hairpin，false priming，選取自認(rèn)為最優(yōu)組合，然后發(fā)給公司合成回來之后，先用easy taq 酶體系跑普通pcr，凝膠檢測結(jié)果條帶比較暗，然后又用RT-PCR檢測了一次，無數(shù)據(jù)出現(xiàn)，電泳檢測，也沒有目的條帶出現(xiàn) 第二次設(shè)計RT-PCR是用NCBI網(wǎng)站來設(shè)計的，直接在上面輸入CDS序列，搜索引物，然后按照上面搜過結(jié)果，選取成對的引物，Tm值在60+-3 大都很相近 ,然后引物自身的dimer（NTI檢測，約2~5個），偶爾有發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在， 直接送公司合成回來后，直接用的RT-PCR檢測，也無條帶出現(xiàn) 已確定cDNA無問題，RT-PCR試劑盒為 快精（英文名字好像是QIjin還是什么的，公司當(dāng)初取名快精還被笑稱過豬飼料） 引物長度為20~22左右，經(jīng)過NCBI與目的材料全基因組比對之后，除了目的染色體上面引物全部匹配外，還有其他染色體約7~8個，是14~16個堿基連續(xù)匹配的，我有一個疑問，就是按照這個匹配度來說，RT-PCR是不是至少會有帶出現(xiàn)，不會出現(xiàn)無數(shù)據(jù)的情況吧、？ 還有一個就是RT-PCR引物設(shè)計問題，小白一個，初次接觸這個，真心不懂，設(shè)計了兩次之后，都沒效果，不知道該咋辦了，真心求助�。�！ |
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