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weizhi111至尊木蟲 (正式寫手)
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[求助]
怎樣提高融合蛋白表達量 已有6人參與
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| 在BL21菌株中誘導(dǎo)表達蛋白，用的是GST標(biāo)簽，做了幾次發(fā)現(xiàn)上清里面誘導(dǎo)的蛋白很少，掛柱洗脫后幾乎看不見條帶。沉淀（包涵體）蛋白還比較多。誘導(dǎo)條件試過IPTG 0.5mM 16度過夜，但IPTG 改成0.3mM 16度過夜后總體誘導(dǎo)表達量就減少了，上清沉淀都少，該怎么解決呢？最后蛋白是要用來測酶活的，所以誘導(dǎo)純化過程不能破壞酶活。請有經(jīng)驗者幫助！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 像樓上說的，不知道樓主搖菌轉(zhuǎn)速多少，太快也不好，我們實驗室常用170rpm，我也做過幾次BL21的GST蛋白提取，加的時0.4mM的IPTG，30度3小時，回收量還不錯，還有，根據(jù)培養(yǎng)基的組成不同，也會很大程度的影響蛋白產(chǎn)生量，比如，我回收TBP的時候，起初，用的培養(yǎng)基是Tryptone or polypeptone 5g，NaCl 1.25 g，NH4Cl 0.5g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO412H2O 4.01g，up to 500ml, 取50ml培養(yǎng)回收，這時效率，上清大概是沉淀的50%（上清含量少），而后，我將培養(yǎng)基改成NaCl 0.5 g，NH4Cl 1g，KH2PO4 3g，Na2HPO412H2O 15g，up to 500ml；用時另外加入：1M MgSO4 1ml，2M Glucose 5.6ml，1% Vitamin B1(thiamine) 1ml，1M CaCl2 0.1ml。取50ml培養(yǎng)回收，反應(yīng)條件30度2-4小時 OD600:0.4～0.8后加入IPTG，之后16度 24小時，回收TBP效率提高一倍。當(dāng)然這也只是我做的個例，不能保證適用于所有的蛋白，僅供樓主參考，可以考慮改變下培養(yǎng)基成分，祝樓主早日解決問題。 |
7樓2015-08-03 20:13:41
wufeng1991
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2樓2015-08-02 21:32:35
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3樓2015-08-03 08:40:19
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4樓2015-08-03 13:11:46
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