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weizhi111至尊木蟲 (正式寫手)
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怎樣提高融合蛋白表達(dá)量 已有6人參與
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| 在BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，用的是GST標(biāo)簽，做了幾次發(fā)現(xiàn)上清里面誘導(dǎo)的蛋白很少，掛柱洗脫后幾乎看不見條帶。沉淀（包涵體）蛋白還比較多。誘導(dǎo)條件試過IPTG 0.5mM 16度過夜，但I(xiàn)PTG 改成0.3mM 16度過夜后總體誘導(dǎo)表達(dá)量就減少了，上清沉淀都少，該怎么解決呢？最后蛋白是要用來測(cè)酶活的，所以誘導(dǎo)純化過程不能破壞酶活。請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)者幫助！ |
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| 像樓上說的，不知道樓主搖菌轉(zhuǎn)速多少，太快也不好，我們實(shí)驗(yàn)室常用170rpm，我也做過幾次BL21的GST蛋白提取，加的時(shí)0.4mM的IPTG，30度3小時(shí)，回收量還不錯(cuò)，還有，根據(jù)培養(yǎng)基的組成不同，也會(huì)很大程度的影響蛋白產(chǎn)生量，比如，我回收TBP的時(shí)候，起初，用的培養(yǎng)基是Tryptone or polypeptone 5g，NaCl 1.25 g，NH4Cl 0.5g，KH2PO4 1.5g，Na2HPO412H2O 4.01g，up to 500ml, 取50ml培養(yǎng)回收，這時(shí)效率，上清大概是沉淀的50%（上清含量少），而后，我將培養(yǎng)基改成NaCl 0.5 g，NH4Cl 1g，KH2PO4 3g，Na2HPO412H2O 15g，up to 500ml；用時(shí)另外加入：1M MgSO4 1ml，2M Glucose 5.6ml，1% Vitamin B1(thiamine) 1ml，1M CaCl2 0.1ml。取50ml培養(yǎng)回收，反應(yīng)條件30度2-4小時(shí) OD600:0.4～0.8后加入IPTG，之后16度 24小時(shí)，回收TBP效率提高一倍。當(dāng)然這也只是我做的個(gè)例，不能保證適用于所有的蛋白，僅供樓主參考，可以考慮改變下培養(yǎng)基成分，祝樓主早日解決問題。 |
7樓2015-08-03 20:13:41
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9樓2015-08-04 14:44:03
【答案】應(yīng)助回帖
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| 你可以從IPTG的濃度、誘導(dǎo)的溫度、誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)速以及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行摸索，IPTG濃度過高會(huì)使得包涵體含量增加，BL21是大腸桿菌，最適溫度37℃，但是建議往下降溫度，溫度過高合成蛋白速率過快就有可能造成目的蛋白來不及正確折疊因而大部分形成包涵體，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速過快也是是一樣。本人也是剛開始做，一點(diǎn)點(diǎn)小經(jīng)驗(yàn)可以參考一下。有時(shí)候你可以試著換換載體或者宿主細(xì)胞，表達(dá)量也會(huì)不同。我用過Transtta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)量會(huì)比BL21高，只是我個(gè)人這樣，你可以試試。 |
10樓2015-08-04 14:45:57
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