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jinggai327

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[交流] pMD19T測(cè)序無(wú)信號(hào) 已有7人參與

大家有沒(méi)有用過(guò)TAKARA的pMD19T載體？
我構(gòu)建了4種質(zhì)粒，自己PCR都沒(méi)問(wèn)題，但是用pMD19T的通用引物測(cè)序時(shí)，3家測(cè)序公司都說(shuō)沒(méi)有信號(hào)，華大說(shuō)通用引物結(jié)合不上去，大家遇到過(guò)這個(gè)問(wèn)題嗎？
是pMD19T載體的質(zhì)量問(wèn)題嗎？

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1樓 2015-09-07 10:10:16

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Huobol

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自己PCR用到載體的通用引物了嗎，一般用M13F-47和M13R-48，序列網(wǎng)上有，退火60℃即可，如果能P出亮的目的條帶就對(duì)了。也可以對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，就是用自己的引物和通用引物做4個(gè)組合再進(jìn)行PCR，其中只有兩個(gè)組合能P出亮帶，因?yàn)椴迦胄蛄械姆较虿淮_定。比如，用特異引物和通用引物都是下游引物以及都是上游引物時(shí)才能P出條帶，出現(xiàn)這種情況說(shuō)明序列是反向插入的。自己檢測(cè)試試吧，沒(méi)問(wèn)題的。

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3樓2015-09-07 14:14:14

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xrxleisure

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要么就是送測(cè)序的菌液和質(zhì)粒有問(wèn)題，寶生物的PMD19-T挺好用的，再做一次試試吧。

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2樓2015-09-07 13:54:12

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duanh19

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你是用3批菌液或者質(zhì)粒的嗎？每次測(cè)序之前有沒(méi)有做通用引物PCR確認(rèn)呢，有時(shí)候，細(xì)菌被污染了也是測(cè)不出來(lái)的。

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4樓2015-09-07 14:29:17

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hbincs

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經(jīng)常碰到這樣的問(wèn)題

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5樓2015-09-07 15:25:06

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3樓: Originally posted by Huobol at 2015-09-07 14:14:14
自己PCR用到載體的通用引物了嗎，一般用M13F-47和M13R-48，序列網(wǎng)上有，退火60℃即可，如果能P出亮的目的條帶就對(duì)了。也可以對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，就是用自己的引物和通用引物做4個(gè)組合再進(jìn)行PCR，其 ...

感謝你的回復(fù)。都是用自己的引物P的，沒(méi)有用通用引物P。但是不管正向還是反向都應(yīng)該有序列才對(duì)吧�，F(xiàn)在是根本拿不到序列。

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6樓2015-09-07 15:26:05

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4樓: Originally posted by duanh19 at 2015-09-07 14:29:17
你是用3批菌液或者質(zhì)粒的嗎？每次測(cè)序之前有沒(méi)有做通用引物PCR確認(rèn)呢，有時(shí)候，細(xì)菌被污染了也是測(cè)不出來(lái)的。

感謝你的回復(fù)。是2批菌液，質(zhì)粒都是重新提取的。每次都是用自己的引物PCR確認(rèn)的，沒(méi)有用通用引物。而且我從基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物也P出了相應(yīng)條帶，所以如果說(shuō)是自己的構(gòu)建有問(wèn)題我想不通。

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7樓2015-09-07 15:29:16

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2樓: Originally posted by xrxleisure at 2015-09-07 13:54:12
要么就是送測(cè)序的菌液和質(zhì)粒有問(wèn)題，寶生物的PMD19-T挺好用的，再做一次試試吧。

感謝你的回復(fù)。我們實(shí)驗(yàn)室買過(guò)近10幾年的pMD19T，感覺(jué)有的年份好，有的不好用，不知道是不是自己碰上了好運(yùn)氣。

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8樓2015-09-07 15:31:00

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5樓: Originally posted by hbincs at 2015-09-07 15:25:06
經(jīng)常碰到這樣的問(wèn)題

感謝你的回復(fù)。我以前也用過(guò)pMD19T當(dāng)過(guò)渡質(zhì)粒，但沒(méi)在這里測(cè)序。原來(lái)也有同命相連的啊。

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9樓2015-09-07 15:32:41

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大孫20111987

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你是用質(zhì)粒送測(cè)，還是菌液。要是菌液送測(cè)沒(méi)信號(hào)的話可以試試送質(zhì)粒。我之前也有過(guò)這種情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌液驗(yàn)證的其實(shí)都是假陽(yáng)性。

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做好自己，堅(jiān)持到底

10樓2015-09-07 15:39:30

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