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andywang6137木蟲 (著名寫手)
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[求助]
最近TA克隆老是失敗，請大家分析一下。 已有9人參與
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PCR產(chǎn)物，膠回收后TA克隆，板子總長成這樣，請高手分析一下原因。taq酶，寶生物的；膠回收試劑盒，全式金的；T載體，用過生工和全式金的。感受態(tài)細(xì)胞，全式金和自己制備的。之前還做出來了，上學(xué)的時(shí)候TA克隆也沒出過問題，現(xiàn)在涂的板子老是長成下面圖片這樣。我自己動(dòng)手做了一次，2個(gè)研究生做了一次都是下面的結(jié)果（圖1：準(zhǔn)備回收的目的片段；圖2-4，平板菌液，學(xué)生發(fā)過來的，忘記那一個(gè)是水做的對照）。分析不出來原因，請高手分析一下。謝謝！ 0.jpg 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細(xì)解答 2015-10-08 10:42:31
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andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細(xì)解答 2015-10-08 10:42:31
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看平板，似乎不是樓上幾位說的簡單的濃度太高，本人分析原因可能有以下介個(gè)： 1. 如果目的片段很短（小于500 bp），復(fù)蘇時(shí)間較長（超過1小時(shí)），涂板前進(jìn)行了集菌，會出現(xiàn)上述情況，如樓上幾位所說，改進(jìn)方法就是縮短復(fù)蘇時(shí)間或者取消該步，然后減少涂板菌量； 2. 感受態(tài)問題，我曾出現(xiàn)過，制備感受態(tài)的菌污染，導(dǎo)致制備的感受態(tài)是含有質(zhì)粒的，這樣的話即使是用水做轉(zhuǎn)化也會出現(xiàn)上述情況，建議排查； 3. 檢查一下抗生素是否失效，這種情況我也遇到過，無論怎么轉(zhuǎn)化均出現(xiàn)上述情況，后來發(fā)現(xiàn)抗生素失效，用了新的抗生素，立馬正常了，如果使用的抗生素與質(zhì)粒上的抗性基因不一致也會出現(xiàn)上述情況，建議排查； 4. 如果上述情況均不是主要原因，可以考慮藍(lán)白斑篩選加陰陽性對照，找到產(chǎn)生上述情況的原因 祝好 |
5樓2015-09-26 10:08:53
chenli1017
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2樓2015-09-25 18:33:37
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4樓2015-09-25 20:08:16
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