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andywang6137木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
最近TA克隆老是失敗，請(qǐng)大家分析一下。 已有9人參與
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PCR產(chǎn)物，膠回收后TA克隆，板子總長(zhǎng)成這樣，請(qǐng)高手分析一下原因。taq酶，寶生物的；膠回收試劑盒，全式金的；T載體，用過(guò)生工和全式金的。感受態(tài)細(xì)胞，全式金和自己制備的。之前還做出來(lái)了，上學(xué)的時(shí)候TA克隆也沒(méi)出過(guò)問(wèn)題，現(xiàn)在涂的板子老是長(zhǎng)成下面圖片這樣。我自己動(dòng)手做了一次，2個(gè)研究生做了一次都是下面的結(jié)果（圖1：準(zhǔn)備回收的目的片段；圖2-4，平板菌液，學(xué)生發(fā)過(guò)來(lái)的，忘記那一個(gè)是水做的對(duì)照）。分析不出來(lái)原因，請(qǐng)高手分析一下。謝謝！ 0.jpg 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
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西門(mén)吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細(xì)解答 2015-10-08 10:42:31
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andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細(xì)解答 2015-10-08 10:42:31
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看平板，似乎不是樓上幾位說(shuō)的簡(jiǎn)單的濃度太高，本人分析原因可能有以下介個(gè)： 1. 如果目的片段很短（小于500 bp），復(fù)蘇時(shí)間較長(zhǎng)（超過(guò)1小時(shí)），涂板前進(jìn)行了集菌，會(huì)出現(xiàn)上述情況，如樓上幾位所說(shuō)，改進(jìn)方法就是縮短復(fù)蘇時(shí)間或者取消該步，然后減少涂板菌量； 2. 感受態(tài)問(wèn)題，我曾出現(xiàn)過(guò)，制備感受態(tài)的菌污染，導(dǎo)致制備的感受態(tài)是含有質(zhì)粒的，這樣的話即使是用水做轉(zhuǎn)化也會(huì)出現(xiàn)上述情況，建議排查； 3. 檢查一下抗生素是否失效，這種情況我也遇到過(guò)，無(wú)論怎么轉(zhuǎn)化均出現(xiàn)上述情況，后來(lái)發(fā)現(xiàn)抗生素失效，用了新的抗生素，立馬正常了，如果使用的抗生素與質(zhì)粒上的抗性基因不一致也會(huì)出現(xiàn)上述情況，建議排查； 4. 如果上述情況均不是主要原因，可以考慮藍(lán)白斑篩選加陰陽(yáng)性對(duì)照，找到產(chǎn)生上述情況的原因 祝好 |
5樓2015-09-26 10:08:53
andywang6137
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首先謝謝你詳細(xì)的回答。關(guān)于你分析的幾個(gè)原因，我做一下說(shuō)明，你看還有沒(méi)有什么建議： 1、目的片段大約750bp，我用的是2K的marher。轉(zhuǎn)化之后復(fù)蘇時(shí)間1個(gè)小時(shí)左右，有的時(shí)候時(shí)間比較長(zhǎng)（不超過(guò)2小時(shí)），沒(méi)有集菌。涂板用量50ul。個(gè)人感覺(jué)搖菌時(shí)間這一塊應(yīng)該可以?xún)?yōu)化，縮短一下時(shí)間看看效果。 2、感受態(tài)，買(mǎi)的感受態(tài)和自己制備的感受態(tài)現(xiàn)在都出現(xiàn)這種狀況。之前我自己做的，做出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的感受態(tài)細(xì)胞也是目前這種情況。感受態(tài)這一塊拿不準(zhǔn)，買(mǎi)的感受態(tài)，自己制作的和學(xué)生做的，都出現(xiàn)這樣的狀況。 3、Amp的問(wèn)題。這個(gè)之前沒(méi)考慮到，一直以為可能是載體和感受態(tài)的問(wèn)題，兩個(gè)都換過(guò)還是沒(méi)有解決問(wèn)題。Amp準(zhǔn)備重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal沒(méi)有用。 4、陰陽(yáng)性對(duì)照，學(xué)生報(bào)道說(shuō)也是上述情況。上述圖片其中一個(gè)是加水的對(duì)照。 5、請(qǐng)問(wèn)板子中一團(tuán)糊的也是因?yàn)闈舛忍叩木壒�，還是其他原因？涂板用量已經(jīng)縮小到50ul。涂板不均勻這個(gè)試驗(yàn)中很常見(jiàn)，挑到目的基因克隆子即可。一團(tuán)糊的我一直難以理解，重新做新的培養(yǎng)基也是這個(gè)情況。要說(shuō)濃度高，上學(xué)的時(shí)候經(jīng)常做，濃度也有非常高的，可沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)一團(tuán)糊的情況。 讀書(shū)時(shí)做TA克隆基本沒(méi)有失敗過(guò)，目前出現(xiàn)這種情況換了一些試劑盒條件，始終沒(méi)有找到有效的解決辦法。 |
7樓2015-09-27 20:29:13
chenli1017
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2樓2015-09-25 18:33:37
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樓上正解，涂板時(shí)候少加點(diǎn)菌液，涂均勻點(diǎn) 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
3樓2015-09-25 20:00:12
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4樓2015-09-25 20:08:16
andywang6137
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6樓2015-09-27 20:12:33
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8樓2015-09-27 20:36:54
andywang6137
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9樓2015-09-27 20:57:23
【答案】應(yīng)助回帖
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按你說(shuō)的情況，加水也出現(xiàn)上述情況，那么就只有兩種原因了，就是我說(shuō)的第二三兩種，按你所說(shuō)感受態(tài)出問(wèn)題的可能性不大，那么就是抗生素的問(wèn)題了，你可以挑取五到十個(gè)菌斑，用M13通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如果絕大部分有產(chǎn)物，說(shuō)明抗生素沒(méi)問(wèn)題，如果大部分無(wú)產(chǎn)物，抗生素失效，不過(guò)前提是感受態(tài)沒(méi)問(wèn)題，最好換換抗生素吧 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
10樓2015-09-27 22:28:06
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