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andywang6137木蟲 (著名寫手)
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[求助]
最近TA克隆老是失敗，請(qǐng)大家分析一下。 已有9人參與
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PCR產(chǎn)物，膠回收后TA克隆，板子總長(zhǎng)成這樣，請(qǐng)高手分析一下原因。taq酶，寶生物的；膠回收試劑盒，全式金的；T載體，用過生工和全式金的。感受態(tài)細(xì)胞，全式金和自己制備的。之前還做出來(lái)了，上學(xué)的時(shí)候TA克隆也沒出過問題，現(xiàn)在涂的板子老是長(zhǎng)成下面圖片這樣。我自己動(dòng)手做了一次，2個(gè)研究生做了一次都是下面的結(jié)果（圖1：準(zhǔn)備回收的目的片段；圖2-4，平板菌液，學(xué)生發(fā)過來(lái)的，忘記那一個(gè)是水做的對(duì)照）。分析不出來(lái)原因，請(qǐng)高手分析一下。謝謝！ 0.jpg 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
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andywang6137
木蟲 (著名寫手)
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首先謝謝你詳細(xì)的回答。關(guān)于你分析的幾個(gè)原因，我做一下說(shuō)明，你看還有沒有什么建議： 1、目的片段大約750bp，我用的是2K的marher。轉(zhuǎn)化之后復(fù)蘇時(shí)間1個(gè)小時(shí)左右，有的時(shí)候時(shí)間比較長(zhǎng)（不超過2小時(shí)），沒有集菌。涂板用量50ul。個(gè)人感覺搖菌時(shí)間這一塊應(yīng)該可以優(yōu)化，縮短一下時(shí)間看看效果。 2、感受態(tài)，買的感受態(tài)和自己制備的感受態(tài)現(xiàn)在都出現(xiàn)這種狀況。之前我自己做的，做出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的感受態(tài)細(xì)胞也是目前這種情況。感受態(tài)這一塊拿不準(zhǔn)，買的感受態(tài)，自己制作的和學(xué)生做的，都出現(xiàn)這樣的狀況。 3、Amp的問題。這個(gè)之前沒考慮到，一直以為可能是載體和感受態(tài)的問題，兩個(gè)都換過還是沒有解決問題。Amp準(zhǔn)備重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal沒有用。 4、陰陽(yáng)性對(duì)照，學(xué)生報(bào)道說(shuō)也是上述情況。上述圖片其中一個(gè)是加水的對(duì)照。 5、請(qǐng)問板子中一團(tuán)糊的也是因?yàn)闈舛忍叩木壒�，還是其他原因？涂板用量已經(jīng)縮小到50ul。涂板不均勻這個(gè)試驗(yàn)中很常見，挑到目的基因克隆子即可。一團(tuán)糊的我一直難以理解，重新做新的培養(yǎng)基也是這個(gè)情況。要說(shuō)濃度高，上學(xué)的時(shí)候經(jīng)常做，濃度也有非常高的，可沒有出現(xiàn)過一團(tuán)糊的情況。 讀書時(shí)做TA克隆基本沒有失敗過，目前出現(xiàn)這種情況換了一些試劑盒條件，始終沒有找到有效的解決辦法。 |
7樓2015-09-27 20:29:13
chenli1017
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2樓2015-09-25 18:33:37
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3樓2015-09-25 20:00:12
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4樓2015-09-25 20:08:16
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