 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4914 | 回復: 22 | ||
andywang6137木蟲 (著名寫手)
|
[求助]
最近TA克隆老是失敗，請大家分析一下。 已有9人參與
|
|
|
PCR產物，膠回收后TA克隆，板子總長成這樣，請高手分析一下原因。taq酶，寶生物的；膠回收試劑盒，全式金的；T載體，用過生工和全式金的。感受態(tài)細胞，全式金和自己制備的。之前還做出來了，上學的時候TA克隆也沒出過問題，現(xiàn)在涂的板子老是長成下面圖片這樣。我自己動手做了一次，2個研究生做了一次都是下面的結果（圖1：準備回收的目的片段；圖2-4，平板菌液，學生發(fā)過來的，忘記那一個是水做的對照）。分析不出來原因，請高手分析一下。謝謝！ 0.jpg 1.jpg 2.jpg 3.jpg |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經有174人回復
-
蛋白質檢測：精準分析，解鎖生物分子的密碼
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設計，解析生命機制的重要載體
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經有0人回復
-
納米粒度分析
已經有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細解答 2015-10-08 10:42:31
感謝參與，應助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2015-09-27 23:03:59
andywang6137: 金幣+30, 感謝詳細解答 2015-10-08 10:42:31
|
看平板，似乎不是樓上幾位說的簡單的濃度太高，本人分析原因可能有以下介個： 1. 如果目的片段很短（小于500 bp），復蘇時間較長（超過1小時），涂板前進行了集菌，會出現(xiàn)上述情況，如樓上幾位所說，改進方法就是縮短復蘇時間或者取消該步，然后減少涂板菌量； 2. 感受態(tài)問題，我曾出現(xiàn)過，制備感受態(tài)的菌污染，導致制備的感受態(tài)是含有質粒的，這樣的話即使是用水做轉化也會出現(xiàn)上述情況，建議排查； 3. 檢查一下抗生素是否失效，這種情況我也遇到過，無論怎么轉化均出現(xiàn)上述情況，后來發(fā)現(xiàn)抗生素失效，用了新的抗生素，立馬正常了，如果使用的抗生素與質粒上的抗性基因不一致也會出現(xiàn)上述情況，建議排查； 4. 如果上述情況均不是主要原因，可以考慮藍白斑篩選加陰陽性對照，找到產生上述情況的原因 祝好 |
5樓2015-09-26 10:08:53
andywang6137
木蟲 (著名寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1552.5
- 散金: 309
- 紅花: 25
- 帖子: 1651
- 在線: 460.3小時
- 蟲號: 607807
- 注冊: 2008-09-20
- 專業(yè): 食品加工技術
|
首先謝謝你詳細的回答。關于你分析的幾個原因，我做一下說明，你看還有沒有什么建議： 1、目的片段大約750bp，我用的是2K的marher。轉化之后復蘇時間1個小時左右，有的時候時間比較長（不超過2小時），沒有集菌。涂板用量50ul。個人感覺搖菌時間這一塊應該可以優(yōu)化，縮短一下時間看看效果。 2、感受態(tài)，買的感受態(tài)和自己制備的感受態(tài)現(xiàn)在都出現(xiàn)這種狀況。之前我自己做的，做出實驗結果的感受態(tài)細胞也是目前這種情況。感受態(tài)這一塊拿不準，買的感受態(tài)，自己制作的和學生做的，都出現(xiàn)這樣的狀況。 3、Amp的問題。這個之前沒考慮到，一直以為可能是載體和感受態(tài)的問題，兩個都換過還是沒有解決問題。Amp準備重新定一只新的。涂板只用了Amp，IPTG和x-gal沒有用。 4、陰陽性對照，學生報道說也是上述情況。上述圖片其中一個是加水的對照。 5、請問板子中一團糊的也是因為濃度太高的緣故，還是其他原因？涂板用量已經縮小到50ul。涂板不均勻這個試驗中很常見，挑到目的基因克隆子即可。一團糊的我一直難以理解，重新做新的培養(yǎng)基也是這個情況。要說濃度高，上學的時候經常做，濃度也有非常高的，可沒有出現(xiàn)過一團糊的情況。 讀書時做TA克隆基本沒有失敗過，目前出現(xiàn)這種情況換了一些試劑盒條件，始終沒有找到有效的解決辦法。 |
7樓2015-09-27 20:29:13
chenli1017
木蟲 (小有名氣)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 2437.4
- 散金: 100
- 紅花: 3
- 帖子: 58
- 在線: 70.7小時
- 蟲號: 3158888
- 注冊: 2014-04-23
- 專業(yè): 果樹學
2樓2015-09-25 18:33:37
songjie851
新蟲 (初入文壇)
- 應助: 4 (幼兒園)
- 金幣: 1919.4
- 散金: 10
- 帖子: 47
- 在線: 45.5小時
- 蟲號: 1752626
- 注冊: 2012-04-12
- 專業(yè): 色譜分析
3樓2015-09-25 20:00:12
cosmoslight
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1916.1
- 帖子: 67
- 在線: 12.8小時
- 蟲號: 493621
- 注冊: 2008-01-10
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物生理與生物化學
4樓2015-09-25 20:08:16
andywang6137
木蟲 (著名寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1552.5
- 散金: 309
- 紅花: 25
- 帖子: 1651
- 在線: 460.3小時
- 蟲號: 607807
- 注冊: 2008-09-20
- 專業(yè): 食品加工技術
6樓2015-09-27 20:12:33
mr.clutch
新蟲 (小有名氣)
- 應助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 1324
- 帖子: 123
- 在線: 76.9小時
- 蟲號: 3105636
- 注冊: 2014-04-01
- 專業(yè): 代數(shù)學
8樓2015-09-27 20:36:54
andywang6137
木蟲 (著名寫手)
- 應助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1552.5
- 散金: 309
- 紅花: 25
- 帖子: 1651
- 在線: 460.3小時
- 蟲號: 607807
- 注冊: 2008-09-20
- 專業(yè): 食品加工技術
9樓2015-09-27 20:57:23
【答案】應助回帖
|
按你說的情況，加水也出現(xiàn)上述情況，那么就只有兩種原因了，就是我說的第二三兩種，按你所說感受態(tài)出問題的可能性不大，那么就是抗生素的問題了，你可以挑取五到十個菌斑，用M13通用引物進行PCR驗證，如果絕大部分有產物，說明抗生素沒問題，如果大部分無產物，抗生素失效，不過前提是感受態(tài)沒問題，最好換換抗生素吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2015-09-27 22:28:06
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 andywang6137 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0856調劑，是學校就去 +8 | sllhht 2026-03-19 | 9/450 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 招收調劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
[考研] 085700資源與環(huán)境308求調劑 +10 | 墨墨漠 2026-03-18 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 求調劑 +3 | 暗涌afhb 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 288求調劑 +15 | 于海海海海 2026-03-19 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 294求調劑材料與化工專碩 +14 | 陌の森林 2026-03-18 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調劑 +7 | 為學666 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 本科鄭州大學物理學院，一志愿華科070200學碩，346求調劑 +4 | 我不是一根蔥 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調劑 +6 | 司空. 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 化學工程321分求調劑 +15 | 大米飯！ 2026-03-15 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 085601專碩，總分342求調劑，地區(qū)不限 +5 | share_joy 2026-03-16 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學調劑 +3 | 妮妮ninicgb 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 268求調劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 326求調劑 +5 | 上岸的小葡 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料工程專碩274一志愿211求調劑 +6 | 薛云鵬 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 274求調劑 +5 | 時間點 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 機械專碩325，尋找調劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 321求調劑 +5 | 大米飯！ 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070303 總分349求調劑 +3 | LJY9966 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 26考研一志愿中國石油大學(華東)305分求調劑 +3 | 嘉年新程 2026-03-15 | 3/150 |
|