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923158905銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
二相代謝孵育體系溶液配制 已有1人參與
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想請(qǐng)教些問題，我做的是葡萄糖醛酸化反應(yīng)，關(guān)于孵育體系的配制，我需要配制四種溶液A（UDPGA）；B(D-葡萄糖二酸1,4-內(nèi)酯，丙甲菌素，MgCl2)；C（樣品溶液）；D（UGT酶溶液），然后將溶液冷凍分裝，使用時(shí)溶解移取適量體積，使孵育體系總體積為100 uL。 （1）UDPGA不太穩(wěn)定，是不是不可以配成溶液長期冷凍保存，要現(xiàn)配現(xiàn)用？配成溶液冷凍保存有什么影響？ （2）我能把B溶液和D溶液配制在一起，作為一個(gè)溶液嗎？ （3）我只知道反復(fù)凍融對(duì)酶的活性有影響，所以要將酶溶液分裝成小份以減少凍融次數(shù)，但其他的溶液（A,B,C)還需要分裝成小份進(jìn)行保存嗎? （4）丙甲菌素在水中的溶解性怎樣啊？可以直接用緩沖液配制嗎？ 謝謝大家！ |
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2樓2015-10-18 10:31:03
3樓2015-10-19 08:51:31
man㵘
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【答案】應(yīng)助回帖
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923158905: 金幣+30, ★★★很有幫助, 謝謝你的幫助，回答的好詳細(xì)，贊一個(gè)~\(≧▽≦)/~ 2015-10-19 21:46:02
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(1)UDPGA要現(xiàn)配現(xiàn)用。如果你真的要配成溶液冷凍，建議挑幾個(gè)對(duì)照化合物，做一下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，看看冷凍后是否有影響。 2）不建議配在一起 3）最好都配成小份，凍存。 (4）丙甲菌素在書中溶解性一般。建議配在DMSO等有機(jī)相，配成高濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)取少量加到反應(yīng)體系。 PS.做科研，最好每一步都嚴(yán)格按要求來，否則一旦有問題，很難分析原因。如果想節(jié)省步奏，改變條件，一定要先做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 還有個(gè)問題，如果你用的是基因工程技術(shù)生成的UGT酶，應(yīng)該就不需要丙甲菌素了吧。我們用microsomes做實(shí)驗(yàn)，才加丙甲菌素，目的是穿孔，讓UGT釋放出來。 |
4樓2015-10-19 15:11:21
923158905
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5樓2015-10-19 15:41:21
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我購買的UGT酶全稱：Human UGT2B7 SUPERSOMES 說明如下：This activity is catalyzed by UGT2B7 which is expressed from human UGT2B7 cDNA using a baculovirus expression system. Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes. A membrane preparation using wild type virus (Catalog No.456400) should be used as a control for native activities. 其中有句話：Baculovirus infected insect cells (BTI-TN-5B1-4) were used to prepare these membranes。這是說酶是附著在細(xì)胞膜上嗎？我看文獻(xiàn)中UGT2B7重組酶中加的是丙甲菌素，我就跟著加了，請(qǐng)問是不是肝腸微粒體要加丙甲菌素，而基因工程生產(chǎn)的酶因?yàn)闆]有細(xì)胞膜所以就不要加？ 關(guān)于UDPGA溶液配制問題，由于孵育體系較小，若現(xiàn)配現(xiàn)用，那么UDPGA溶液要配制的體積很小，大約100 uL到500 uL，請(qǐng)問我直接用移液槍移取定量體積緩沖液將UDPGA溶解可以嗎？直接將UDPGA固體加入孵育體系應(yīng)該是不可取的吧？請(qǐng)問你是怎樣操作的�。恐x謝！ |
6樓2015-10-19 21:41:54
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7樓2015-10-22 11:06:54
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我現(xiàn)在是建立孵育體系，建立的體系沒有代謝，我的體系是 肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸單內(nèi)酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM） 做的時(shí)候，先將丙甲菌素與肝S9置于冰上15min進(jìn)行穿孔，后加入其他試劑預(yù)孵育5分鐘，最后加入U(xiǎn)DPGA啟動(dòng)反應(yīng) 我用對(duì)硝基苯酚作為陽性對(duì)照，也沒有代謝，肝S9應(yīng)該沒有問題額，因?yàn)樽鲆幌嗟臅r(shí)候，就有活性，現(xiàn)在不知道是怎么回事額， |
8樓2016-01-25 18:35:31
左非非考復(fù)旦
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我現(xiàn)在是建立孵育體系，建立的體系沒有代謝，我的體系是 肝S9(1mg/ml)+丙甲菌素（50μg/ml）+PBS+MgCl2(5mM)+D-葡糖二酸單內(nèi)酯（5mM）+UDPGA(5mM)+底物（12μM） 做的時(shí)候，先將丙甲菌素與肝S9置于冰上15min進(jìn)行穿孔，后加入其他試劑預(yù)孵育5分鐘，最后加入U(xiǎn)DPGA啟動(dòng)反應(yīng) 我用對(duì)硝基苯酚作為陽性對(duì)照，也沒有代謝，肝S9應(yīng)該沒有問題額，因?yàn)樽鲆幌嗟臅r(shí)候，就有活性，現(xiàn)在不知道是怎么回事額， |
9樓2016-01-25 18:35:47
10樓2016-03-11 14:51:46
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