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Deng_Cheng鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 已有3人參與
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1. 當(dāng)OD=0.6左右時，加入IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，如果設(shè)置對照為不加入IPTG，則對照組經(jīng)過相同的誘導(dǎo)條件后，菌液發(fā)生了什么變化，是一直在繁殖嗎？ 2. 原核表達(dá)時，IPTG誘導(dǎo)時，如何設(shè)置對照？ |
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2樓2015-10-19 13:23:48
Deng_Cheng
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3樓2015-10-19 15:08:50
4樓2015-10-19 17:40:39
Deng_Cheng
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5樓2015-10-19 19:31:11
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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實驗方案 1. 用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因； 2. 按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中； 3. 分別挑取單菌落接種于5mL LB(0.1g/L 氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)過夜； 4. 以2%體積比轉(zhuǎn)接于2ml LB(0.1g/L 氨芐青霉素)中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5hr，至細(xì)菌對數(shù)生長期，加0.1mmol/L IPTG 2μl誘導(dǎo)3-4hr，同時設(shè)立不加IPTG誘導(dǎo)作為對照； 5. 取上述菌液 1mL，12000rpm離心10min，收菌沉淀； 6. 重懸于冰的100μl PBS中，加入PMSF至終濃度為10mmol/L。震蕩器震蕩混勻，加入2×加樣緩沖液，煮沸10min變性，12,000rpm離心10min； 7. 分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的樣品10μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。 （PS：如果表達(dá)載體的原核啟動子為PL啟動子，則在30-32℃培養(yǎng)數(shù)小時，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6，迅速使溫度升至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3-5h；如果表達(dá)載體的原核啟動子為tac等，則37℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時達(dá)到對數(shù)生長期后加IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3-5h） 摘自原核蛋白表達(dá)純化>原核蛋白表達(dá)純化 |
6樓2015-10-20 09:15:43
7樓2015-10-20 12:11:06
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本帖內(nèi)容被屏蔽 |
8樓2015-10-21 11:27:27
han3028730
新蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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我認(rèn)為，對照應(yīng)為空載質(zhì)粒，而不是不加IPTG,原因如下： 1.IPTG會抑制細(xì)胞生長，以不加IPTG為對照，那么對照組和實驗組的菌體生長不同步，在以后全細(xì)胞蛋白分析中，大腸桿菌自身的蛋白會有較大差異，影響判斷。 2.培養(yǎng)基中成分復(fù)雜，比如LB培養(yǎng)基中的酵母抽提物含有少量乳糖，就算不加IPTG，蛋白也會被乳糖誘導(dǎo)，導(dǎo)致蛋白分析時背景表達(dá)影響實驗結(jié)果。 3.以空載載體做空白，對照和實驗組都加IPTG，那么實驗中的變量就是有無目的基因的表達(dá)。這樣就不存在蛋白的背景表達(dá)，之后的蛋白分析就十分方便且清晰，并且可以評估外源蛋白表達(dá)對菌體生長的影響。 [ 發(fā)自小木蟲客戶端 ] |
9樓2015-10-21 15:35:56
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