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LY1199鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的問題 已有1人參與
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我用絕對定量的 qPCR 測定某個基因A在土壤樣品中的copy數(shù)目 查了好多文獻，大都是：采用還有這個A基因的單拷貝質(zhì)粒DNA進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，將其稀釋到一定倍數(shù)， 這里產(chǎn)生了疑問 1）為什么要構(gòu)建含A基因的單拷貝質(zhì)粒 2）直接利用A基因的PCR產(chǎn)物進行目的片段濃度確定，再轉(zhuǎn)換成copies/ul等形式，不可以嗎？？為什么？？ |
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LY1199
鐵蟲 (小有名氣)
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2樓2015-10-20 09:28:39
高gaoeryang
銀蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
LY1199: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-11-21 14:10:34
LY1199: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-11-21 14:10:34
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使用質(zhì)粒有以下原因： （1） 很多實驗者都推薦之。 （2） 質(zhì)粒比較純。 （3） 質(zhì)粒穩(wěn)定。 （4） 質(zhì)粒定量準(zhǔn)確。 （5） 質(zhì)粒制備方便，廉價，大量。 （6） 使用質(zhì)粒來開始學(xué)習(xí)/試驗real time PCR, 可以減少模板誤差，就易于摸索其它條件的優(yōu)化。 PCR產(chǎn)物也可以，但是： （1） 短，線性→不穩(wěn)定。 （2） 模板就是擴增子，末端就是引物結(jié)合部位，端點降解直接影響引物結(jié) 合。 |
3樓2015-10-23 16:48:04
懶蛋
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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樓上完全正確。此外 pcr 產(chǎn)物做模版，擴增效率沒有質(zhì)粒高，有時可能卡在70%再上不去了。因為引物anneal到質(zhì)粒上的概率要高于pcr 片段，因為pcr兩端再無其他序列可target。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2015-10-26 00:11:27
劉阿杰T
新蟲 (小有名氣)
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5樓2017-11-22 10:25:32
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