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sty5959596新蟲 (初入文壇)
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[求助]
多糖HPLC衍生后結(jié)果。。。 已有2人參與
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各位同僚~~多糖結(jié)構(gòu)糾結(jié)死了。做的柱前衍生，PMP法。結(jié)果出來就這樣了。。。。響應(yīng)值好低，我這是過完SephadexG75后的純化樣品，蛋白含量很低。沒想到就這樣了，衍生的時候做了三個平行。另外附一張標(biāo)準(zhǔn)品阿拉伯糖的液相圖，一樣的衍生方法。大家能不能給分析一下。。。 H1.png H2.png H3.png Arab.png |
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qingxiayuan
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【答案】應(yīng)助回帖
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sty5959596(sytucom代發(fā)): 金幣+2, 回帖精彩，謝謝參與 2015-11-18 22:35:46
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1.不知道你的阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品是不是被污染了，我們也有過被污染的情況，出來兩個峰 2.基線有沒有跑平，或者流動相有沒有被污染了 3.不清楚你的衍生方法及液相條件，PMP衍生我做過5次了，每次都成功，一般來說標(biāo)品峰都很高，樣品峰比較低。 另外附我的衍生方法： 5 mg多糖樣品，用蒸餾水配成5 mg/mL，取100 µL加入到具塞小管中,加入4 mol/L三氟乙酸(TFA) 100 µL并充氮?dú)夥夤埽?20 ℃水解2 h。然后向冷卻水解液中加入甲醇約200 µL，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，如此重復(fù)3次，蒸干后向其中加100µL蒸餾水作衍生化反應(yīng)使用。 100 µL酸水解后樣品加入100 µL O.6M NaOH�；靹颉⑷缓笕∩鲜龌旌弦�100 µL,并向其中添加100 µL 0.5 M PMP甲醇溶液,漩渦混勻后,將混合物加熱到70 ℃,反應(yīng)lOO min,冷卻至室溫后,再用50 µL的0.3 M HCl中和反應(yīng)液。反應(yīng)混合物在50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,向其中加入1 mL蒸餾水和1 mL氯仿,混勻后,小心吸取水相，棄氯仿層,萃取過程重復(fù)3次以除去PMP,抽提后的水相反應(yīng)液用0.45 µm濾膜過濾后HPLC檢測。 HPLC檢測。條件如下:檢測柱,RP-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 µm Venusil, USA)；柱溫,30℃；流動相,0.1 M PBS (pH 6.7)和乙腈比例(v/v)為 83:17；流速，l.O mL/min；檢測波長,245 nm。 |
2樓2015-11-16 11:38:23
w911227
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6樓2015-11-16 16:51:18
sunyan901122
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你阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度太大了�？茨銟悠分袉翁浅煞痔嗔�，跑成這個樣不應(yīng)該啊，是樣品處理的問題吧。前幾個月我也做糖了，你可以看我的主頁下面我發(fā)的帖子，效果還可以。提醒你下樣品中阿拉伯糖和木糖用液相是分不開的，如果有木糖就不能定量。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2015-11-17 00:53:14
sty5959596
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我這是頭一次做衍生，標(biāo)品濃度是大了點(diǎn)，是10mg/ml，下次得稀釋十倍了。樣品的話，可能是我的水解有問題吧…或者是PMP沒除掉…根據(jù)文獻(xiàn)得知，我的樣品里面，應(yīng)該就只有一種糖…不應(yīng)該這么多雜峰的…我也沒想到出來這么多雜峰…不知道該怎么解決，求指教？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
8樓2015-11-17 07:09:09
sty5959596
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多謝回復(fù)，我們實(shí)驗(yàn)室做糖的就只有兩個人，沒有師兄師姐。所以基本我的實(shí)驗(yàn)都是自己看文獻(xiàn)摸索出來的。PMP衍生我做了兩次了，頭一次用的TSKgel Sugar AXG的柱子，沒跑出來。這是第二次，用的C18柱，出峰了，但是不好看。 附上我的衍生方法，大神給看下： 純化多糖配成3-4mg/ml糖液，取100微升糖液加100微升4M TFA，100℃下水解4小時，水解后冷卻至室溫，再加入200微升甲醇，混勻后氮?dú)獯蹈�，重�?fù)三次。干燥后的水解樣品溶于100微升蒸餾水中，待衍生。 衍生：100微升水解樣品加入100微升0.6M NaOH溶液，混合后取50微升混合液再加入50微升 0.5M 的PMP甲醇溶液，混勻。70℃下溫浴100分鐘，取出后冷卻，加入50微升0.3M HCl中和�；旌弦捍蹈伞Ｔ偌尤胨吐确逻M(jìn)行萃取，萃取三次，水相層過膜待上樣。液相條件跟你的一樣。。。。。 |
3樓2015-11-16 14:46:08
sty5959596
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5樓2015-11-16 15:05:57
sunyan901122
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看你的樣品峰，標(biāo)準(zhǔn)品濃度我覺得200ug/ml足夠。怎么看你標(biāo)準(zhǔn)品里都有雜峰？再自己做個三五次原因都能找出來。流動相是什么，出峰時間有點(diǎn)長啊。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2015-11-17 12:58:14
sty5959596
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流動相是磷酸鹽緩沖液pH6.7，和乙腈…83比17的比例。我之前有看到過一篇文獻(xiàn)上有人用pH10的緩沖液，可是我的c18柱最大承受就是10，所以我沒敢用10的緩沖液 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2015-11-17 13:02:00
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