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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 引物設計及PCR相關問題
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[求助]
引物設計及PCR相關問題 已有2人參與
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各位，本人研三，之前師姐師兄在的時候好多問題沒搞明白他們就畢業(yè)了，最近有問題，只能上小木蟲求助一下。 最近在做酶的克隆表達，想從篩選到的菌株中釣取酶基因，之前設計了一對引物，特異性不是很好，可能有錯配，導致PCR產(chǎn)物有非特異性條帶，之后做過目的條帶膠回收之后作為模板，也做過退火溫度梯度，還降低過模板量和引物濃度，都沒有特別好的單一條帶的結(jié)果。于是糾結(jié)是不是要重新設計一對引物，這次換了個目的條帶，用PP5設計的引物，至少保證了不加酶切位點的時候沒有錯配，可是發(fā)現(xiàn)不加酶切位點的時候評分可以達到100，但是加了酶切位點之后就又出現(xiàn)了二聚體和發(fā)卡。情況大概介紹完了，總結(jié)一下要問的問題： 1． 加酶切位點之后評分降低，怎么解決？可以直接用嗎？還是需要做一些調(diào)整？另外加了酶切位點之后，產(chǎn)生了一個六個堿基左右的錯配，這樣的引物還能用嗎？可是錯配中有四個堿基是由酶切位點引起的，而我現(xiàn)在沒辦法換酶切位點，怎么解決？ 2． 兩個引物之間Tm值和GC比相差較大？如何解決？如果用同義密碼子進行替換，是否會對引物的特異性產(chǎn)生影響。 3． 之前做二次PCR的時候，做了個溫度梯度，同時平行做了兩管，出現(xiàn)了一管有條帶，另一管全是抹帶，一會上圖，大家給鑒定一下原因唄？DL2000 marker 之后四個分別是退火溫度為48,50,52,54. 左右兩塊膠是平行的兩管。 4． 最近跟老師討論PCR，他說我的操作不規(guī)范，應該將每種東西都打到側(cè)壁上，之后用手指輕彈管壁，用濺起的水珠將壁上的液滴沖洗下去，離心后再進行PCR，而我之前的做法都是加完水之后將所有東西都加到液面以下，老師說我們的槍頭不是進口的，會帶出來一些液體，想問一下大家都是怎么做的？兩種方法有很大差異嗎？ 5． 看到有人說可以拿設計的引物在NCBI上blast一下，研究了許久，都未成功，可否有哪位大神指點一下具體步驟？ 6． 想問一下正引物這樣的，在酶切位點之前加了兩個保護堿基，翻譯的時候是否會引起位移？另外，大腸桿菌表達的時候是否利用TTG當起始密碼子的比較少？第一次設計的引物是： 正：5'> CGGGATCCATGTTGTCTAGACGTCGTATCG <3' 反：5'> CCCAAGCTTTCAACAGTACAGGTTGCCG <3' 目的片段是： TTGTCGAGACGCCGTATCGCCGCCGTCACCGCCGCCCTCGTCCTCGCCGGAAGCGCCCCGATGCTGCTCCCCGCCGCGGCCACCACCGCCTCGGCCGCCACCGCGGCCGCGTGTTCTAGCTACCCCGCCTGGGTCGCCGGACAGTGGTACGAGGCCGGTGCGATCGTCCGTTACACCGACGGCAAGGCGTACATCGCCGAGCACGCCAACCCGGGTTACGACCCGACCGTCAGCACCTGGTACTGGGAGCCCTACGCCTGTGACAACGGGCCCGGGACGCCCGTCGGGAACTTCGTCGTGACCGAGGCACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAACCGGAACCCCTTCTACACCTACAGCGGCCTCACCGCCGCGCTCAGCGCCTACCCCGGCTTCGCCAACACCGGGAGCGACACGGTGAAGAAGCAGGAGGCCGCCGCCTTCCTCGCCAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGTCTGGTCCACGTCGTGGAGCAGAACCAGGCCAACTACCCGCACTACTGCGACTGGGGCCGGCCGTACGGCTGCCCGGCCGGCCAGGCCGCCTACTACGGGCGCGGTCCCATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCGGGCGACGCGTTGGGCATCGACCTGCTGAACAACCCCTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCCGTCGCCTGGAAGACCGCCCTCTGGTACTGGAACACCCAGACCGGTCCGGGCAGCATGACCGGCCATGCCGCCATGGTGAACGGGGCCGGTTTCGGCCAGACGATCCGCAGCATCAACGGCTCGCTGGAGTGCGACGGCAGGAACCCGGCGCAGGTCCAGAGCCGGGTGACGAAGTACCAGCAGTTCACCCAGATCCTCGGGACGACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA 7.第二次設計的引物是： 正：5'> CGCGGATCCATGCCATCCCCCCACCGCT<3' 反：5'> CCCAAGCTTCTACCGGATGGCCTTGAT<3' 目的片段是：ATGCCATCCCCCCACCGCTCCCGCACGCTGCGGGCGCTCGTGTCCGCCGCCTGTACCGCCGTGCTCGGCGCCGGACTGCTCGCCGGCACGGGCGCCTCGACCGCCACCGCGGCGACCTCGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGGTTCGAAGGTCGTCGGCTACTTCACCGAATGGGGCACCTACGACCGGCAGTACTACGTCAGGAACATCGAGACGTCCGGGTCCGCGGACCGGCTCACCCACATCAACTACGCCTTCGGCAACGTCACCGGCGGCAAGTGCGCCATCGGCGACGCCTACGCGGCCACCGACCGCGCCTACACCGCCGAGGAGTCCGTCGACGGAGTCGCGGACACCTGGGACCAGCCGCTGCGCGGCACCTTCAACCAGCTGCGGAAGCTGAAGGAGAAGCACCCCGGCCTCAAGGTGATCTGGTCCTTCGGCGGCTGGACCTGGTCCGGCGGCTTCGGCGAGGCCGCGAAGAACCCGGCCGCCTTCGCGCAGTCCTGCCTGGACCTGGTGGAGGACCCGCGCTGGGCCGGCGTCTTCGACGGCATCGACATCGACTGGGAGTACCCGAACGCCTGCGGCGCCACCTGCGACACCAGCGGCCGTGACGCCTACCGCGAACTGATGGCGGCGCTGCGCTCCACGTTCGGCCCCGACCGGCTGGTCACCGCCGCGATCCCGGCCGACGCCACCGACGGCGGCAAGATCGACGCGGCCGACTACGCCGGCGCCGCCCCGTACGTCGACTGGTACAACCCGATGACGTACGACTTCTTCGGCGCCTGGGACACCGCCGGGCCGACCGCCCCGCACTCGCCGCTGACCTCGTACGACGGCATCCCGAAGGCGGAGTACCACAGCGCCGCCACCATCGCGAAGCTGACCGGTCTCGGCGTCCCCGCGGACAAGCTGCTGCTCGGCATCGGCTTCTACGGCCGCGGCTGGACCGGCGTCACCCAGGCGGAGCCGGGCGGCACCGCGACCGGCCCCGCGCCGGGCACGTACGAGGCGGGGATCGACGACTACAAGGTCCTCAAGGACAGGTGCCCCGCGACCGGCACGGTCGGCGGCACCGCCTACGCCCGGTGCGGCGACCAGTGGTGGAGCTACGACACCCCGGAGACCGTCGCCTCCAAGACGGAGTGGAAGAACCAGCAGGGCCTCGGCGGCACGTTCTTCTGGGAGCTCAGCGGCGACACCGCGAACGGTGAGCTGATCAAGGCCATCCGGTAG 退火溫度梯度.JPG |
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3樓2015-12-10 23:50:50
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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1. 可以用，酶切位點對你片段的擴增沒有任何影響啊。但要注意一點，你是做表達，所以序列要對框，也就是如果你的蛋白前邊有標簽或者從載體序列開始翻譯，要保證能夠跟你的蛋白ORF對上。 2.可以通過增加酶切位點的保護堿基來進行調(diào)節(jié)。 3.PCR有些擴不出來原因比較難說，但你有的樣本能出來，說明體系問題不大。建議不要糾結(jié)失敗的原因，用括出來的片段繼續(xù)往前走，保持實驗進度推進。 4. 我認為你的做法是對的，而且我也是這么做的，沒啥問題。注意先配好緩沖體系，其他成分逐步往里加。 5. 直接去NCBI 的blast就可以，選類型（蛋白or核酸），物種等，然后SUBMIT 6. 保護堿基不會引起突變，因為酶切的時候都切掉了啊。起始密碼子是ATG，沒聽說過TTG。 希望有所幫助。 |
4樓2015-12-11 09:57:11
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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1.評分降低沒有關系啊，十全十美的引物很少，能擴出你的片段就行。至于你的錯配堿基，為什么不能換酶切位點，表達載體一般不都好多個酶切位點嗎？真不能換那就只能這樣了。 2.兩個引物之間Tm值比較大的話，可以用touch down程序跑。 3.退火溫度我最低用過50度，溫度越低，引物的特異性結(jié)合越差，可以試試提高退火溫度，比如60度。 4.你老師說的很對，但我覺得影響不大，按照你的方法加的話，你加完后可以用槍頭稍微吹打幾下再離心。 5.我也沒做過引物比對。。。 6.保護堿基切掉了不影響。TTG的起始密碼子？沒聽說過啊，可能我孤陋寡聞了 最后，有雜帶不要緊啊，里面只要有你的目的條帶就行，你最終不是要做蛋白表達嗎？把大小符合的條帶切下來回收測序，做連接轉(zhuǎn)化表達就是，何必糾結(jié)pcr的條帶單一不單一？ |
5樓2015-12-11 12:18:56
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