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alanyatou新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)及PCR相關(guān)問(wèn)題 已有2人參與
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各位，本人研三，之前師姐師兄在的時(shí)候好多問(wèn)題沒(méi)搞明白他們就畢業(yè)了，最近有問(wèn)題，只能上小木蟲(chóng)求助一下。 最近在做酶的克隆表達(dá)，想從篩選到的菌株中釣取酶基因，之前設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，特異性不是很好，可能有錯(cuò)配，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物有非特異性條帶，之后做過(guò)目的條帶膠回收之后作為模板，也做過(guò)退火溫度梯度，還降低過(guò)模板量和引物濃度，都沒(méi)有特別好的單一條帶的結(jié)果。于是糾結(jié)是不是要重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，這次換了個(gè)目的條帶，用PP5設(shè)計(jì)的引物，至少保證了不加酶切位點(diǎn)的時(shí)候沒(méi)有錯(cuò)配，可是發(fā)現(xiàn)不加酶切位點(diǎn)的時(shí)候評(píng)分可以達(dá)到100，但是加了酶切位點(diǎn)之后就又出現(xiàn)了二聚體和發(fā)卡。情況大概介紹完了，總結(jié)一下要問(wèn)的問(wèn)題： 1． 加酶切位點(diǎn)之后評(píng)分降低，怎么解決？可以直接用嗎？還是需要做一些調(diào)整？另外加了酶切位點(diǎn)之后，產(chǎn)生了一個(gè)六個(gè)堿基左右的錯(cuò)配，這樣的引物還能用嗎？可是錯(cuò)配中有四個(gè)堿基是由酶切位點(diǎn)引起的，而我現(xiàn)在沒(méi)辦法換酶切位點(diǎn)，怎么解決？ 2． 兩個(gè)引物之間Tm值和GC比相差較大？如何解決？如果用同義密碼子進(jìn)行替換，是否會(huì)對(duì)引物的特異性產(chǎn)生影響。 3． 之前做二次PCR的時(shí)候，做了個(gè)溫度梯度，同時(shí)平行做了兩管，出現(xiàn)了一管有條帶，另一管全是抹帶，一會(huì)上圖，大家給鑒定一下原因唄？DL2000 marker 之后四個(gè)分別是退火溫度為48,50,52,54. 左右兩塊膠是平行的兩管。 4． 最近跟老師討論P(yáng)CR，他說(shuō)我的操作不規(guī)范，應(yīng)該將每種東西都打到側(cè)壁上，之后用手指輕彈管壁，用濺起的水珠將壁上的液滴沖洗下去，離心后再進(jìn)行PCR，而我之前的做法都是加完水之后將所有東西都加到液面以下，老師說(shuō)我們的槍頭不是進(jìn)口的，會(huì)帶出來(lái)一些液體，想問(wèn)一下大家都是怎么做的？?jī)煞N方法有很大差異嗎？ 5． 看到有人說(shuō)可以拿設(shè)計(jì)的引物在NCBI上blast一下，研究了許久，都未成功，可否有哪位大神指點(diǎn)一下具體步驟？ 6． 想問(wèn)一下正引物這樣的，在酶切位點(diǎn)之前加了兩個(gè)保護(hù)堿基，翻譯的時(shí)候是否會(huì)引起位移？另外，大腸桿菌表達(dá)的時(shí)候是否利用TTG當(dāng)起始密碼子的比較少？第一次設(shè)計(jì)的引物是： 正：5'> CGGGATCCATGTTGTCTAGACGTCGTATCG <3' 反：5'> CCCAAGCTTTCAACAGTACAGGTTGCCG <3' 目的片段是： TTGTCGAGACGCCGTATCGCCGCCGTCACCGCCGCCCTCGTCCTCGCCGGAAGCGCCCCGATGCTGCTCCCCGCCGCGGCCACCACCGCCTCGGCCGCCACCGCGGCCGCGTGTTCTAGCTACCCCGCCTGGGTCGCCGGACAGTGGTACGAGGCCGGTGCGATCGTCCGTTACACCGACGGCAAGGCGTACATCGCCGAGCACGCCAACCCGGGTTACGACCCGACCGTCAGCACCTGGTACTGGGAGCCCTACGCCTGTGACAACGGGCCCGGGACGCCCGTCGGGAACTTCGTCGTGACCGAGGCACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAACCGGAACCCCTTCTACACCTACAGCGGCCTCACCGCCGCGCTCAGCGCCTACCCCGGCTTCGCCAACACCGGGAGCGACACGGTGAAGAAGCAGGAGGCCGCCGCCTTCCTCGCCAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGTCTGGTCCACGTCGTGGAGCAGAACCAGGCCAACTACCCGCACTACTGCGACTGGGGCCGGCCGTACGGCTGCCCGGCCGGCCAGGCCGCCTACTACGGGCGCGGTCCCATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCGGGCGACGCGTTGGGCATCGACCTGCTGAACAACCCCTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCCGTCGCCTGGAAGACCGCCCTCTGGTACTGGAACACCCAGACCGGTCCGGGCAGCATGACCGGCCATGCCGCCATGGTGAACGGGGCCGGTTTCGGCCAGACGATCCGCAGCATCAACGGCTCGCTGGAGTGCGACGGCAGGAACCCGGCGCAGGTCCAGAGCCGGGTGACGAAGTACCAGCAGTTCACCCAGATCCTCGGGACGACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA 7.第二次設(shè)計(jì)的引物是： 正：5'> CGCGGATCCATGCCATCCCCCCACCGCT<3' 反：5'> CCCAAGCTTCTACCGGATGGCCTTGAT<3' 目的片段是：ATGCCATCCCCCCACCGCTCCCGCACGCTGCGGGCGCTCGTGTCCGCCGCCTGTACCGCCGTGCTCGGCGCCGGACTGCTCGCCGGCACGGGCGCCTCGACCGCCACCGCGGCGACCTCGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGGTTCGAAGGTCGTCGGCTACTTCACCGAATGGGGCACCTACGACCGGCAGTACTACGTCAGGAACATCGAGACGTCCGGGTCCGCGGACCGGCTCACCCACATCAACTACGCCTTCGGCAACGTCACCGGCGGCAAGTGCGCCATCGGCGACGCCTACGCGGCCACCGACCGCGCCTACACCGCCGAGGAGTCCGTCGACGGAGTCGCGGACACCTGGGACCAGCCGCTGCGCGGCACCTTCAACCAGCTGCGGAAGCTGAAGGAGAAGCACCCCGGCCTCAAGGTGATCTGGTCCTTCGGCGGCTGGACCTGGTCCGGCGGCTTCGGCGAGGCCGCGAAGAACCCGGCCGCCTTCGCGCAGTCCTGCCTGGACCTGGTGGAGGACCCGCGCTGGGCCGGCGTCTTCGACGGCATCGACATCGACTGGGAGTACCCGAACGCCTGCGGCGCCACCTGCGACACCAGCGGCCGTGACGCCTACCGCGAACTGATGGCGGCGCTGCGCTCCACGTTCGGCCCCGACCGGCTGGTCACCGCCGCGATCCCGGCCGACGCCACCGACGGCGGCAAGATCGACGCGGCCGACTACGCCGGCGCCGCCCCGTACGTCGACTGGTACAACCCGATGACGTACGACTTCTTCGGCGCCTGGGACACCGCCGGGCCGACCGCCCCGCACTCGCCGCTGACCTCGTACGACGGCATCCCGAAGGCGGAGTACCACAGCGCCGCCACCATCGCGAAGCTGACCGGTCTCGGCGTCCCCGCGGACAAGCTGCTGCTCGGCATCGGCTTCTACGGCCGCGGCTGGACCGGCGTCACCCAGGCGGAGCCGGGCGGCACCGCGACCGGCCCCGCGCCGGGCACGTACGAGGCGGGGATCGACGACTACAAGGTCCTCAAGGACAGGTGCCCCGCGACCGGCACGGTCGGCGGCACCGCCTACGCCCGGTGCGGCGACCAGTGGTGGAGCTACGACACCCCGGAGACCGTCGCCTCCAAGACGGAGTGGAAGAACCAGCAGGGCCTCGGCGGCACGTTCTTCTGGGAGCTCAGCGGCGACACCGCGAACGGTGAGCTGATCAAGGCCATCCGGTAG 退火溫度梯度.JPG |
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uulovelyuu
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 可以用，酶切位點(diǎn)對(duì)你片段的擴(kuò)增沒(méi)有任何影響啊。但要注意一點(diǎn)，你是做表達(dá)，所以序列要對(duì)框，也就是如果你的蛋白前邊有標(biāo)簽或者從載體序列開(kāi)始翻譯，要保證能夠跟你的蛋白ORF對(duì)上。 2.可以通過(guò)增加酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。 3.PCR有些擴(kuò)不出來(lái)原因比較難說(shuō)，但你有的樣本能出來(lái)，說(shuō)明體系問(wèn)題不大。建議不要糾結(jié)失敗的原因，用括出來(lái)的片段繼續(xù)往前走，保持實(shí)驗(yàn)進(jìn)度推進(jìn)。 4. 我認(rèn)為你的做法是對(duì)的，而且我也是這么做的，沒(méi)啥問(wèn)題。注意先配好緩沖體系，其他成分逐步往里加。 5. 直接去NCBI 的blast就可以，選類型（蛋白o(hù)r核酸），物種等，然后SUBMIT 6. 保護(hù)堿基不會(huì)引起突變，因?yàn)槊盖械臅r(shí)候都切掉了啊。起始密碼子是ATG，沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)TTG。 希望有所幫助。 |
4樓2015-12-11 09:57:11
alanyatou
新蟲(chóng) (初入文壇)
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2樓2015-12-10 22:43:36
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與其卡在這里，不如交給公司設(shè)計(jì)，花不了多少錢，不然會(huì)影響你實(shí)驗(yàn)進(jìn)度 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
3樓2015-12-10 23:50:50
草蔻年華
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【答案】應(yīng)助回帖
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1.評(píng)分降低沒(méi)有關(guān)系啊，十全十美的引物很少，能擴(kuò)出你的片段就行。至于你的錯(cuò)配堿基，為什么不能換酶切位點(diǎn)，表達(dá)載體一般不都好多個(gè)酶切位點(diǎn)嗎？真不能換那就只能這樣了。 2.兩個(gè)引物之間Tm值比較大的話，可以用touch down程序跑。 3.退火溫度我最低用過(guò)50度，溫度越低，引物的特異性結(jié)合越差，可以試試提高退火溫度，比如60度。 4.你老師說(shuō)的很對(duì)，但我覺(jué)得影響不大，按照你的方法加的話，你加完后可以用槍頭稍微吹打幾下再離心。 5.我也沒(méi)做過(guò)引物比對(duì)。。。 6.保護(hù)堿基切掉了不影響。TTG的起始密碼子？沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)啊，可能我孤陋寡聞了 最后，有雜帶不要緊啊，里面只要有你的目的條帶就行，你最終不是要做蛋白表達(dá)嗎？把大小符合的條帶切下來(lái)回收測(cè)序，做連接轉(zhuǎn)化表達(dá)就是，何必糾結(jié)pcr的條帶單一不單一？ |
5樓2015-12-11 12:18:56
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