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我是一只老年新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
板子上長(zhǎng)出菌落，但是菌落PCR沒(méi)有得到目的片段 已有5人參與
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我要在PCS2+上連接nrf2a和gfp目的基因，其中nrf2a已經(jīng)連接上，現(xiàn)在要連接gfp，設(shè)計(jì)了兩個(gè)酶切位點(diǎn)，not1和sac2，可是這兩個(gè)酶切位點(diǎn)很相近。 現(xiàn)在nrf2a連接上了，要連接gfp了，用takara的T4連接酶22度連接了2小時(shí)，涂氨芐板子，放于37度培養(yǎng)了14h左右，長(zhǎng)出了菌落，但是菌落都是呈現(xiàn)那種半透明的樣子。用引物PCS2+-F和M13-R擴(kuò)增，只有1761左右的nrf2a大小，gfp并沒(méi)有連接上。到底什么原因？求助連接體系怎么確定��？ 濃度.jpg 鏈接公式.jpg 鏈接體系.jpg 板子.jpg PCR程序.jpg nrf2a-gfp-pcs2+ pcr.jpg |
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not1這個(gè)酶酶切效率不高，建議延長(zhǎng)酶切時(shí)間，也有可能是兩個(gè)酶切為點(diǎn)太近，你可以分別單酶切， 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
2樓2016-01-19 11:15:36
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| The ligation system worked perfectly. The problem came from the double digestion reaction incompletely. Therefore, you could digest the backbone vector in two single digestion reaction step by step. Anyway, please set up the negative control just without insert DNA, which is used for the identification of digestion efficiency. |
3樓2016-01-19 12:04:27
4樓2016-01-20 08:04:20
5樓2016-01-20 08:04:42
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7樓2016-01-22 11:58:48
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