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yanshuai511銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
GPCR蛋白N端連flag不表達(dá)！急！
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| FLAG 連在G 蛋白耦連的受體的N端，做了兩個(gè)月了還是沒(méi)有進(jìn)展。測(cè)序是正確的，也沒(méi)有移碼�？蓋estern就是檢測(cè)不到FLAG的表達(dá)。受體的ATG帶著和不帶著我都做了，也不表達(dá)。轉(zhuǎn)染的時(shí)間24h和48h我也做過(guò)了。載體也換過(guò)，還是不表達(dá)。我看有的文章說(shuō)GPCR，有的是有糖基化，所以會(huì)影響融合蛋白表達(dá)的位置。有沒(méi)有做過(guò)給G蛋白耦連受體連flag的大神，幫忙分析一下。 |
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2004294075
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10樓2013-10-08 15:35:42
chenliang_0513
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-07-15 19:46:01
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-07-15 19:46:01
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既然測(cè)序是正確的，那就應(yīng)該ORF沒(méi)用問(wèn)題。WB做不出來(lái)的原因很多的。先手我不知道你在哪兒表達(dá)的，難道是酵母？還怕出現(xiàn)糖基化……如果是酵母一般不需要用wb吧，考染就看的見(jiàn)的；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一般也不需要。估計(jì)你用的還是真核表達(dá)系統(tǒng)。 那么你先要注意自己的載體是不是可以在真核細(xì)胞中表達(dá)？（含真核的啟動(dòng)子，終止序列等）以前用這個(gè)載體做過(guò)其他的基因表達(dá)沒(méi)有？就是最好有正對(duì)照 其次，你最好頂一個(gè)beta-actin或GAPDH的抗體，做內(nèi)參，煮的細(xì)胞就可以，如果能做出來(lái)，證明wb的操作沒(méi)有問(wèn)題，如果做不出來(lái)很可能就是操作的問(wèn)題 我不知道你的抗體是哪個(gè)公司的，推薦用sigma的那個(gè)M4的鼠源的單抗，有些公司的不好用，效價(jià)很低 如果還有問(wèn)題，再聯(lián)系我吧，祝實(shí)驗(yàn)順利！ |
2樓2012-07-15 16:20:07
yanshuai511
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3樓2012-07-15 16:30:42
chenliang_0513
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4樓2012-07-15 16:36:28
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