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木子林夕lms

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[交流] 畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)問題

前期我用Pme I酶線性化pPICZaA載體后進(jìn)行電轉(zhuǎn)SMD1168酵母菌株，挑單菌落，經(jīng)特異性引物與通用引物驗(yàn)證后均為陽性克隆子。在YPD活化后轉(zhuǎn)接到50ml BMGY中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)3.0時(shí)進(jìn)行菌體沉淀，移入100ml BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)。但是誘導(dǎo)好幾次都沒有表達(dá)出蛋白。后面重新?lián)Q了線性化位點(diǎn)（Sac I)，再一次構(gòu)建酵母表達(dá)菌株，驗(yàn)證后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，還是表達(dá)不出蛋白。請(qǐng)教各位做酵母表達(dá)的前輩，幫忙分析下有可能是什么原因造成的呢？

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1樓 2016-09-30 11:50:54

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木子林夕lms

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10樓: Originally posted by lemonvivi at 2016-10-09 18:08:56
你的基因有有優(yōu)化嗎，有可能基因里含有轉(zhuǎn)錄提前終止的序列

我沒有優(yōu)化呢，但是我有對(duì)我的目的基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變。經(jīng)過序列比對(duì)后沒有看到轉(zhuǎn)錄提前終止的序列呢

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13樓2016-10-10 09:40:33

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★
木子林夕lms(金幣+1): 謝謝參與

我在ypds平板上活化，酵母比原核麻煩多了，plasmid電轉(zhuǎn)要與基因組重合，不然表達(dá)不出來，還要看下酵母本身是否對(duì)甲醇敏感的

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4樓2016-10-02 18:14:49

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★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

我也在做蛋白表達(dá)，同樣也是表達(dá)不出來，感覺好痛苦，也希望請(qǐng)教廣大蟲友

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7樓2016-10-07 12:01:14

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肖穎2009

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★ ★ ★
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-10-10 22:42:47

1、確定你要表達(dá)的蛋白可以在酵母中表達(dá)，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道沒有？
2、你的質(zhì)粒線性化后有沒有電泳檢測(cè)線性化的效果？
3、轉(zhuǎn)化后你是直接表達(dá)沒有篩選嗎？我看你都是直接放大的100ml，可以一次多挑幾株菌做小量表達(dá)，有表達(dá)了再放大。

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8樓2016-10-08 15:36:58

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