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[求助]
目的基因連接載體 已有1人參與
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各位大神看看我這個(gè)目的基因和載體連接上了沒有啊 么么么噠 （瓊脂糖凝膠電泳） 目的基因 759bp 載體 4000bp marker200-4500 圖從左往右依次是 marker 目的基因 載體 重組的質(zhì)粒 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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llsskk112233
新蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 專業(yè): 微生物藥物
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請問你質(zhì)粒切了多少，還有你應(yīng)該也需要做轉(zhuǎn)化吧，那你可以再做一個(gè)轉(zhuǎn)化后的pcr來進(jìn)一步驗(yàn)證 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2017-08-10 14:51:39
2樓2017-08-10 14:35:00
4樓2017-08-10 15:38:57
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1、酶有沒有壞 內(nèi)切酶可以找載體分別做單酶切后電泳驗(yàn)證 連接酶可以用單酶切的載體，割膠純化后，讓其自連。注意要作一個(gè)不加連接酶的對照。 連接酶的buffer要小心，它比較容易壞，建議買來后先10－20ul分裝，用一次取一管，多余的部分都扔了，不要反復(fù)凍融。 2、感受態(tài)細(xì)胞 用已知濃度的質(zhì)粒，稀釋后，做轉(zhuǎn)化，涂板，看菌落數(shù)來判斷感受態(tài)的效率。這一步，同時(shí)把平板的問題也解決了。 3、連接比例 多做幾個(gè)比例嘗試，記住一點(diǎn)，不要怕載體不夠，載體過多會(huì)嚴(yán)重影響連接效率的。我的經(jīng)驗(yàn)是，取5ug載體，雙酶切后，割膠純化，溶于100ul水中，再稀釋5－10倍后，取1ul用于10－20ul的連接體系。至于插入片段，根據(jù)電泳結(jié)果，如果比較濃的，就加1ul，很淡的話就加7ul，這個(gè)影響不是很大的。 4、酶切位點(diǎn)的問題 這個(gè)問題比較少見，主要出現(xiàn)在載體上的兩個(gè)酶切位點(diǎn)是連在一起的時(shí)候，可能出現(xiàn)一個(gè)位點(diǎn)切開后，導(dǎo)致另一個(gè)位點(diǎn)的保護(hù)堿基不足而無法切開，這樣的話，你要考慮不要兩個(gè)酶分開切，先切難切的，再切容易切的。 在選擇雙酶切載體的時(shí)候，盡量選擇帶插入片段的質(zhì)粒，這樣載體的雙酶切是否成功比較明確。 |
5樓2017-08-10 16:39:47
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