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關(guān)于目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞提取質(zhì)粒的問(wèn)題。 已有4人參與
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大家好，最近我在做轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，準(zhǔn)備下一步進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21。但是現(xiàn)在遇到了問(wèn)題： 目的基因與載體雙酶切后連接轉(zhuǎn)化（大腸桿菌28a），涂板后長(zhǎng)菌了，我也進(jìn)行挑菌PCR驗(yàn)證，大概挑了40多個(gè)但是只有20多個(gè)是陽(yáng)性的，之后再搖菌準(zhǔn)備提取連接后的質(zhì)粒。第一次搖菌沒(méi)有搖起來(lái)（使用的是挑菌做PCR驗(yàn)證的菌液，可能菌的密度比較�。�，第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了兩次都沒(méi)有成功，都是沒(méi)有我想要的那么大的質(zhì)粒條帶，最上面有一條帶，我拿去問(wèn)老師老師說(shuō)這是基因組DNA，不是質(zhì)粒，但是我現(xiàn)在不知道是哪里出了問(wèn)題。難道是我的菌液污染了？可是搖菌后聞起來(lái)就是大腸桿菌的味道，只是搖菌后的菌量相比正常28a搖起來(lái)量少。我確定步驟也沒(méi)問(wèn)題，因?yàn)槲覀兿嗤瑫r(shí)間一起做的用的同樣的步驟正常的28a質(zhì)粒就可以提出來(lái)。還有就是我發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象，我用的是堿法抽提，第一步需要離心，離心后的沉淀不是白色，有點(diǎn)兒發(fā)粉色的那種，這是為什么呢?除了顏色有問(wèn)題，其他的后續(xù)步驟跟正常一樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有什么差別，再就是最后一步了，沉淀超級(jí)少，少到我用5微升DD水溶后濃度還非常低。很苦惱啊，各位大神幫幫我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證么？還是說(shuō)需要重新進(jìn)行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化？ |
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7樓2014-10-27 10:43:37
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你好，我的目的基因是1119bp，連接體系應(yīng)該是沒(méi)問(wèn)題的，我們實(shí)驗(yàn)室用的都是25微升的體系。我做了四個(gè)對(duì)照： A拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以證明我的質(zhì)粒是否被切開(kāi)，我確定我的酶切酶是好使的（我的酶切位點(diǎn)是EcoRI和XhoI，我之前進(jìn)行過(guò)單酶切驗(yàn)證），結(jié)果是長(zhǎng)了24個(gè)菌落。 B用酶切過(guò)的未進(jìn)行連接反應(yīng)的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在這一步中可以證明是否有未被酶切的原始質(zhì)粒，結(jié)果是沒(méi)有長(zhǎng)菌落。 C還以原始質(zhì)粒為對(duì)照，可以檢測(cè)試驗(yàn)過(guò)程中是否有操作問(wèn)題，結(jié)果為長(zhǎng)了很多菌落。 D用無(wú)抗性平板涂感受態(tài)細(xì)胞，證明我的感受態(tài)細(xì)胞沒(méi)問(wèn)題。結(jié)果是長(zhǎng)了菌落的，說(shuō)明感受態(tài)沒(méi)問(wèn)題。 最后就是我自己的連接產(chǎn)物，平板上長(zhǎng)菌落了，而且很多，沒(méi)問(wèn)題，挑菌進(jìn)行PCR后挑選有條帶的進(jìn)行提取質(zhì)粒后雙酶切，可是結(jié)果都顯示的是沒(méi)連上。 我自己分析的原因：1、基因沒(méi)有加上酶切位點(diǎn)導(dǎo)致我沒(méi)切開(kāi)，連不上。2、我的連接酶失效了不好使。 你可以幫我分析一下還有什么原因么？我已經(jīng)在這呆了很久了...沒(méi)辦法進(jìn)行下一步...謝謝。感恩�。�！ |
8樓2014-11-03 16:45:22
9樓2014-12-24 19:57:51
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