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linxiaolin08捐助貴賓 (初入文壇)
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關(guān)于目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞提取質(zhì)粒的問題。 已有4人參與
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大家好，最近我在做轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，準(zhǔn)備下一步進行雙酶切驗證后轉(zhuǎn)化表達菌株BL21。但是現(xiàn)在遇到了問題： 目的基因與載體雙酶切后連接轉(zhuǎn)化（大腸桿菌28a），涂板后長菌了，我也進行挑菌PCR驗證，大概挑了40多個但是只有20多個是陽性的，之后再搖菌準(zhǔn)備提取連接后的質(zhì)粒。第一次搖菌沒有搖起來（使用的是挑菌做PCR驗證的菌液，可能菌的密度比較小），第二次加大了接菌量（大概有150微升菌液），可是提了兩次都沒有成功，都是沒有我想要的那么大的質(zhì)粒條帶，最上面有一條帶，我拿去問老師老師說這是基因組DNA，不是質(zhì)粒，但是我現(xiàn)在不知道是哪里出了問題。難道是我的菌液污染了？可是搖菌后聞起來就是大腸桿菌的味道，只是搖菌后的菌量相比正常28a搖起來量少。我確定步驟也沒問題，因為我們相同時間一起做的用的同樣的步驟正常的28a質(zhì)粒就可以提出來。還有就是我發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，我用的是堿法抽提，第一步需要離心，離心后的沉淀不是白色，有點兒發(fā)粉色的那種，這是為什么呢?除了顏色有問題，其他的后續(xù)步驟跟正常一樣沒有發(fā)現(xiàn)有什么差別，再就是最后一步了，沉淀超級少，少到我用5微升DD水溶后濃度還非常低。很苦惱啊，各位大神幫幫我~~~如果是染菌了我需要重新涂板然后挑菌進行PCR驗證么？還是說需要重新進行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化？ |
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海之草
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4樓2014-10-21 11:09:50
linxiaolin08
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3樓2014-10-21 10:07:16
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