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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 目的基因連接載體
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[求助]
目的基因連接載體 已有1人參與
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各位大神看看我這個目的基因和載體連接上了沒有啊 么么么噠 （瓊脂糖凝膠電泳） 目的基因 759bp 載體 4000bp marker200-4500 圖從左往右依次是 marker 目的基因 載體 重組的質粒 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2017-08-10 14:35:00
llsskk112233
新蟲 (正式寫手)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 558.8
- 散金: 470
- 紅花: 4
- 帖子: 329
- 在線: 264.4小時
- 蟲號: 3938037
- 注冊: 2015-06-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 微生物藥物
3樓2017-08-10 14:51:39
4樓2017-08-10 15:38:57
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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1、酶有沒有壞 內(nèi)切酶可以找載體分別做單酶切后電泳驗證 連接酶可以用單酶切的載體，割膠純化后，讓其自連。注意要作一個不加連接酶的對照。 連接酶的buffer要小心，它比較容易壞，建議買來后先10－20ul分裝，用一次取一管，多余的部分都扔了，不要反復凍融。 2、感受態(tài)細胞 用已知濃度的質粒，稀釋后，做轉化，涂板，看菌落數(shù)來判斷感受態(tài)的效率。這一步，同時把平板的問題也解決了。 3、連接比例 多做幾個比例嘗試，記住一點，不要怕載體不夠，載體過多會嚴重影響連接效率的。我的經(jīng)驗是，取5ug載體，雙酶切后，割膠純化，溶于100ul水中，再稀釋5－10倍后，取1ul用于10－20ul的連接體系。至于插入片段，根據(jù)電泳結果，如果比較濃的，就加1ul，很淡的話就加7ul，這個影響不是很大的。 4、酶切位點的問題 這個問題比較少見，主要出現(xiàn)在載體上的兩個酶切位點是連在一起的時候，可能出現(xiàn)一個位點切開后，導致另一個位點的保護堿基不足而無法切開，這樣的話，你要考慮不要兩個酶分開切，先切難切的，再切容易切的。 在選擇雙酶切載體的時候，盡量選擇帶插入片段的質粒，這樣載體的雙酶切是否成功比較明確。 |
5樓2017-08-10 16:39:47
第二泳道應該是載體單酶切電泳圖，一般驗證目的片段和載體是否連接上的方法：單酶切和載體單酶切跑膠比對，連接產(chǎn)物4759bp，載體4kb，酶切驗證無誤，還需要送到公司測序，測序結果還需要進行NCBI-blast序列比對，直到100%了，才算鏈接成功。還望對你有幫助 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2017-08-11 16:50:35
7樓2017-08-11 16:51:51
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