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時(shí)光Coffee新蟲 (初入文壇)
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[求助]
細(xì)胞提蛋白問題求助 已有3人參與
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1.樓主用RIPA提取細(xì)胞總蛋白時(shí)離心后出現(xiàn)大量透明鼻涕狀物，請(qǐng)問哪位高手知道這是怎么回事兒？ 具體提蛋白操作步驟如下： 25cm2培養(yǎng)瓶細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.5ml胰酶消化---棄胰酶---2ml培養(yǎng)液吹打---取1ml吹打后細(xì)胞懸液于1.5ml離心管---離心去培養(yǎng)液---于沉淀后的細(xì)胞中加細(xì)胞裂解液202ul（RIPA：PMSF=100：1）---吸頭反復(fù)吸取至沉淀細(xì)胞充分混勻于裂解液中---冰上裂解30~40分鐘（樓主有時(shí)不想立即處理會(huì)將其置于冰箱-7°C過夜，第二天進(jìn)實(shí)驗(yàn)室后方才處理）---離心機(jī)4°C，12000rpm，10min離心---吸頭棄去鼻涕狀白色沉淀（但很多次這個(gè)本該是破碎細(xì)胞器的白色沉淀物量很多，且為透明鼻涕狀） 如上所述，那些透明鼻涕狀物是什么？樓主用的是高效RIPA，有可能是因?yàn)楦咝IPA裂解細(xì)胞能力過強(qiáng)將細(xì)胞核裂解后DNA溢出而形成的透明鼻涕狀物嗎？這些透明鼻涕狀物如果丟棄會(huì)不會(huì)影響細(xì)胞總蛋白的含量？該如何避免這個(gè)問題？是不是不能用高效RIPA提取而要換用普通RIPA呢？如果不是高效RIPA的原因，是否跟樓主將細(xì)胞置于冰上裂解過夜，時(shí)間過長(zhǎng)而沒有及時(shí)處理放于-20°C，以至于蛋白變性有關(guān)呢？ 2.提蛋白時(shí)除上述出現(xiàn)的現(xiàn)象外，還出現(xiàn)過離心后上清液最上層有白色絮狀物存在，這些白色絮狀物是什么？如果不去除這些白色絮狀物，WB跑膠時(shí)會(huì)有影響嗎？該如何避免這些白色絮狀物的存在？是不是細(xì)胞太多，裂解液量加的太少以至于沒有將細(xì)胞充分裂解或者是蛋白沒有充分溶解于裂解液中呢？ 上述就是樓主現(xiàn)階段提蛋白出現(xiàn)過的問題，煩請(qǐng)高手賜教，不勝感激！ |
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liuxinyueer
木蟲 (正式寫手)
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5樓2017-06-02 22:37:54
小毛蟲麗麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-06-02 22:41:54
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-06-02 22:41:54
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透明裝物品是基因組DNA復(fù)合物，就是DNA和蛋白或者其它的復(fù)合物，如果不需要可以舍棄。如果需要就超聲破碎、離心提上清。 http://d.dxy.cn/preview/4859890你可以仔細(xì)看看說明書，本人不做蛋白，白色絮狀物不太清楚是什么。 |
4樓2017-06-02 11:14:29
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