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【求助】虛心向大家求教western blot
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各位大俠好！最近開始做western blot，我是新手，所以有些問題請教下大家： 1、從細(xì)胞中提蛋白時(shí)細(xì)胞數(shù)一般要達(dá)到多少��？用6孔板長滿細(xì)胞夠嗎？ 2、蛋白上樣量一般多少合適呢？還有上樣體積？ 3、檢測的時(shí)候用DAB顯色行嗎？顯色后是直接拍照還是用凝膠成像系統(tǒng)保存結(jié)果？ 用ECL怎樣保存結(jié)果呢？ 新手，所以請各位大俠幫助下我！十分感謝！ |
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2樓2011-01-13 15:17:32
★ ★
xiajing_acm(金幣+1):謝謝參與
novus(金幣+1):謝謝交流！ 2011-01-14 15:38:50
xiajing_acm(金幣+2): 2011-04-07 21:12:59
xiajing_acm(金幣+2): 2011-04-12 08:25:32
xiajing_acm(金幣+1):謝謝參與
novus(金幣+1):謝謝交流！ 2011-01-14 15:38:50
xiajing_acm(金幣+2): 2011-04-07 21:12:59
xiajing_acm(金幣+2): 2011-04-12 08:25:32
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1 我們當(dāng)時(shí)一般用6cm平皿做，6孔板的細(xì)胞數(shù)長滿應(yīng)該在100萬左右，也可以做。只不過提取出來的蛋白濃度不一樣。 2 上樣前需要測蛋白濃度，一般用BCA法。然后保證每個(gè)泳道的總蛋白量一致，在30~80μg之間。也就是說每個(gè)孔加的蛋白溶液體積不一樣。但要用PBS補(bǔ)加至每孔上樣體積一致。上樣體積跟個(gè)人技術(shù)也有關(guān)，新手建議控制在20μl以內(nèi)，這就要求你蛋白濃度要大一點(diǎn)，所以最初用6cm平皿比較好。 3 顯色與你使用的抗體也有關(guān)，顯色后用凝膠呈現(xiàn)系統(tǒng)拍照，有的還需要做灰度分析。 建議你去碧云天網(wǎng)站上查看WESTERN相關(guān)試劑的說明書。 |
3樓2011-01-14 11:39:20
簡單回復(fù)
gwf24634樓
2011-02-24 09:17
回復(fù)
xiajing_acm(金幣+1):謝謝參與
yk37825樓
2011-03-26 16:55
回復(fù)
xiajing_acm(金幣+1):謝謝參與
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