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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 生物化學 » 細胞提蛋白問題求助
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[求助]
細胞提蛋白問題求助 已有3人參與
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1.樓主用RIPA提取細胞總蛋白時離心后出現(xiàn)大量透明鼻涕狀物，請問哪位高手知道這是怎么回事兒？ 具體提蛋白操作步驟如下： 25cm2培養(yǎng)瓶細胞長滿后用0.5ml胰酶消化---棄胰酶---2ml培養(yǎng)液吹打---取1ml吹打后細胞懸液于1.5ml離心管---離心去培養(yǎng)液---于沉淀后的細胞中加細胞裂解液202ul（RIPA：PMSF=100：1）---吸頭反復吸取至沉淀細胞充分混勻于裂解液中---冰上裂解30~40分鐘（樓主有時不想立即處理會將其置于冰箱-7°C過夜，第二天進實驗室后方才處理）---離心機4°C，12000rpm，10min離心---吸頭棄去鼻涕狀白色沉淀（但很多次這個本該是破碎細胞器的白色沉淀物量很多，且為透明鼻涕狀） 如上所述，那些透明鼻涕狀物是什么？樓主用的是高效RIPA，有可能是因為高效RIPA裂解細胞能力過強將細胞核裂解后DNA溢出而形成的透明鼻涕狀物嗎？這些透明鼻涕狀物如果丟棄會不會影響細胞總蛋白的含量？該如何避免這個問題？是不是不能用高效RIPA提取而要換用普通RIPA呢？如果不是高效RIPA的原因，是否跟樓主將細胞置于冰上裂解過夜，時間過長而沒有及時處理放于-20°C，以至于蛋白變性有關呢？ 2.提蛋白時除上述出現(xiàn)的現(xiàn)象外，還出現(xiàn)過離心后上清液最上層有白色絮狀物存在，這些白色絮狀物是什么？如果不去除這些白色絮狀物，WB跑膠時會有影響嗎？該如何避免這些白色絮狀物的存在？是不是細胞太多，裂解液量加的太少以至于沒有將細胞充分裂解或者是蛋白沒有充分溶解于裂解液中呢？ 上述就是樓主現(xiàn)階段提蛋白出現(xiàn)過的問題，煩請高手賜教，不勝感激！ |
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2樓2017-06-02 10:32:04
3樓2017-06-02 10:51:48
stabilized
銀蟲 (小有名氣)
- 應助: 62 (初中生)
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- 專業(yè): 微生物遺傳育種學
【答案】應助回帖
★
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-06-02 22:41:54
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2017-06-02 22:41:54
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透明裝物品是基因組DNA復合物，就是DNA和蛋白或者其它的復合物，如果不需要可以舍棄。如果需要就超聲破碎、離心提上清。 http://d.dxy.cn/preview/4859890你可以仔細看看說明書，本人不做蛋白，白色絮狀物不太清楚是什么。 |
4樓2017-06-02 11:14:29
liuxinyueer
木蟲 (正式寫手)
- 應助: 24 (小學生)
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- 專業(yè): 細胞信號轉導
5樓2017-06-02 22:37:54
cathy916
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 消化系統(tǒng)腫瘤
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請問我提蛋白的時候離心之后感覺白色的沉不下去是什么原因呢 以前離心之后總是到底部現(xiàn)在總感覺離的不緊 有白色的絮狀物 很容易離心后吸起來 增加離心時間也不行 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2017-06-07 08:21:29
7樓2017-06-15 10:18:18
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