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sxxuan金蟲 (著名寫手)
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最近原核表達(dá)載體構(gòu)建都是假陽性或陰性多，大家?guī)兔Ψ治鲆幌拢? 已有3人參與
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本來實(shí)驗(yàn)按照流程做都是很順利的，因?yàn)槎际潜容^簡(jiǎn)單的克隆，但最近的問題實(shí)在太多，實(shí)驗(yàn)一拖再拖，我都不好意思面對(duì)同事的詢問了。首先實(shí)驗(yàn)是搬了新的實(shí)驗(yàn)室后開始的，有幾個(gè)原料又買了新的批次 1. 連接酶：倉庫送貨時(shí)下面墊兩個(gè)冰袋，上面疊放著幾包連接酶，這樣送過來，這里的溫度大概28度 2. 酶切：做原核表達(dá)的pET28a載體，我用Takara的BamHI和HindIII雙酶切，載體20ul，酶各1ul，buffer5ul，補(bǔ)水至50ul，雙酶切時(shí)間分別為2，2.5，3h，跑膠發(fā)現(xiàn)3h的跑膠就是全部彌散的，2和2.5h的正常有條帶。而用Fermentas的快速酶切，切20min，拿純化后的載體（理論上是線性的）轉(zhuǎn)化大腸桿菌，還是正常長(zhǎng)菌，可能是有沒有酶切的質(zhì)粒導(dǎo)致的。 3. PCR產(chǎn)物或割膠純化：雙酶切的目的條帶不弱，但純化后拿產(chǎn)物去跑膠都是沒有條帶或很弱。 4. 連接：我們一般是1ul載體，2ul連接酶，2ul buffer，15ul PCR純化產(chǎn)物 5. 感受態(tài)細(xì)胞：買回來后，倉庫的同事用冰袋送過來，或者放到-20了，再給我們送過來放回-80�？棺h過很多次都沒效果，就用TSS法自己做感受態(tài)了 6.轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化后菌的大小不均一，差別挺大的，但沒有拍到圖。挑菌鑒定的話是大的菌落有陽性結(jié)果 7.菌液鑒定：我們都是挑菌落到LB里搖4h左右，加菌液作為模板鑒定，有定性或熒光定量的方法，根據(jù)菌液不同而不同。出現(xiàn)兩種極端情況，一是全部陰性，但PCR純化產(chǎn)物是陽性的有條帶，排除了體系問題。二是全部都是強(qiáng)陽性例如Ct14左右，送測(cè)序都是空載體。正常來講菌液鑒定的Ct值20左右算很正常。 8. 誘導(dǎo)：本來可以正常誘導(dǎo)的菌突然搖不起來，就是測(cè)序正確的菌株，一般1%接種量，2-3h可以到達(dá)OD0.6，加入IPTG誘導(dǎo)，可以得到濃度很高的蛋白，但現(xiàn)在是要6h才能到0.6，然后表達(dá)量比之前低了大概1000-10000倍 我自己是懷疑由于冷鏈的問題，導(dǎo)致連接酶和感受態(tài)細(xì)胞不可用或者效率低。我嘗試過在OD0.2-0.3的時(shí)候誘導(dǎo)，是可以拿到正常濃度的蛋白。 其他方面的問題，請(qǐng)大家多提意見多交流，看下我們有沒有改進(jìn)的方面，最近實(shí)在被這個(gè)折騰慘了 |
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sxxuan
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7樓2016-05-19 09:36:42
yang0071
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sxxuan: 金幣+3, ★★★很有幫助 2016-05-18 16:01:20
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-06-26 06:45:07
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1、這個(gè)一定要改，酶活性不行的話，直接影響后續(xù)工作 2、雙酶切的話，酶的量1ul略多了，結(jié)合第一點(diǎn)，酶可能產(chǎn)出星號(hào)活性，所以條帶彌散； 快速酶切20min，本身就切不完全，只是能切一部分用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn) 3、沒純化好 、、、、 先改掉上述情況，再看 |
2樓2016-05-18 15:03:22
sxxuan
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3樓2016-05-18 16:01:10
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sxxuan: 金幣+5, ★★★很有幫助 2016-05-19 09:36:55
myprayer: 金幣+1, MolEPI+1, 贈(zèng)人玫瑰·手有余香，謝謝你的理解與支持。祝您科研順利，文章多多。 2016-06-25 23:39:49
xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-06-26 06:44:59
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xn8008: 應(yīng)助指數(shù)+1 2016-06-26 06:44:59
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自己也遇到過這種很是怪異的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以前做的好好的突然怎么做都出不來的。此情況下，我主要從下面幾點(diǎn)做起 1，全面消毒，紫外，消毒劑，搖床高溫各種（很有用的，偶爾要不出來菌落，就消下毒就好了） 2，質(zhì)粒重新雙酶切，1h是最長(zhǎng)時(shí)間，大于就會(huì)切雜亂，回收一定要重復(fù)過回收柱，包括洗脫，增大回收效率。 3，單菌落不均一時(shí)，重新轉(zhuǎn)化，控制體系，包括質(zhì)粒最多1ul到100ml感受態(tài)或者連接體系4℃連接后再轉(zhuǎn)化，平板要加大營養(yǎng)。 4，質(zhì)粒單菌落一致后才能做表達(dá)菌，此時(shí)表達(dá)菌的菌落應(yīng)該是均一的，可一管中挑取多個(gè)克隆或者一整片培養(yǎng)。 |
4樓2016-05-18 16:14:06
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