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labglion

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[求助] 求助：PCR擴(kuò)增不出條帶已有3人參與

本人新手，最近在擴(kuò)增RNA病毒中的兩段基因分別為VP1和3D，提取的RNA用通用引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用檢測(cè)引物可以看出條帶很亮，但用擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的引物就擴(kuò)不出來(lái)了，反轉(zhuǎn)錄引物是用的Oligo dT，也嘗試過(guò)自己設(shè)計(jì)的下游引物，PCR引物試了好多，酶也換過(guò)幾種，退火溫度梯度做過(guò)50-60度的，DMSO也試過(guò)，本來(lái)覺(jué)得很簡(jiǎn)單的一點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一直卡在這不動(dòng)了，自己都快沒(méi)有信心了。求大神們不吝賜教。

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1樓 2017-02-28 17:31:26

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5樓: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:44:44
試試在前后各設(shè)計(jì)一對(duì)引物看是否可以擴(kuò)出來(lái)。

這幾天嘗試過(guò)你說(shuō)的這種方法，還是沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)。我懷疑不是引物的問(wèn)題，因?yàn)檎娴囊呀?jīng)嘗試過(guò)了對(duì)很多引物了，有自己設(shè)計(jì)的，也有文獻(xiàn)上的。這么多引物，總該有合適的吧？

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7樓2017-03-09 15:43:44

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自己頂頂，沒(méi)有大神來(lái)幫忙么？想問(wèn)一下除了引物問(wèn)題，會(huì)不會(huì)有可能是RNA在提取過(guò)程斷裂了呢？檢測(cè)引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為358bp，而我想擴(kuò)增的兩段基因長(zhǎng)度分別為762bp和1407bp，有沒(méi)有這個(gè)可能呢？

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2樓2017-03-04 15:51:48

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檢測(cè)引物是什么鬼？這么短的片段應(yīng)該很容易擴(kuò)出來(lái)的，是在做不出來(lái)可以用融合PCR，找找相關(guān)的文獻(xiàn)，直接拿別人的條件應(yīng)該可以做的出來(lái)

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3樓2017-03-04 16:15:37

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3樓: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-03-04 16:15:37
檢測(cè)引物是什么鬼？這么短的片段應(yīng)該很容易擴(kuò)出來(lái)的，是在做不出來(lái)可以用融合PCR，找找相關(guān)的文獻(xiàn)，直接拿別人的條件應(yīng)該可以做的出來(lái)

檢測(cè)引物是我在拿到病料之后用來(lái)檢測(cè)是否含有這種病毒的引物。相關(guān)文獻(xiàn)找過(guò)，用了不少別人的引物也是擴(kuò)不出來(lái)。

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4樓2017-03-04 16:41:58

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