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angjzy木蟲 (小有名氣)
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[求助]
做cDNA的PCR擴增沒有結(jié)果呀！
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做了一個cDNA，用這段基因擴增actin做陽性對照，能擴增出正確片段。 說明體系、模板都沒問題。 用目的基因特異引物擴增，怎么也擴不出來。 這個引物以前有師兄用過，能正確擴出目的片段。 說明引物序列沒問題。 但現(xiàn)在我做怎么也做不出來。 懷疑引物不好用了， 就用了new aliquote 引物，還是擴不出來。 求助大蝦們，這是怎么個情況呀，怎么能把它弄出來呢？ 博士剛開始，就遇到這種問題，崩潰ing~~~ [ Last edited by angjzy on 2011-10-11 at 04:33 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
wanhscn(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-10-11 09:25:41
angjzy(金幣+3): 太謝謝了，我試試。希望大家都順利哈 2011-10-12 01:46:27
wanhscn(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-10-11 09:25:41
angjzy(金幣+3): 太謝謝了，我試試。希望大家都順利哈 2011-10-12 01:46:27
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呵呵 分子方面的實驗就是這個樣子的 總有些說不清道不明的原因 樓主這種原因我以前也經(jīng)常遇到，有時候重復(fù)做幾次PCR就能出來，有時候就是死命都沒結(jié)果。 我的建議就是 1.先重復(fù)幾次實驗，有時候會由于一些比較低級的問題，比如忘加某組分，或者忘記離心，或者其他由于誤差等等原因產(chǎn)生，會出不來結(jié)果，有時候同樣的東西，做兩個重復(fù)也會一個出一個不出，我把這個歸結(jié)為人品不好，暴率比較低的緣故。 2.要弄清楚你擴增片段所處整個mRNA的位置，說簡單點，你的ACTIN能擴出來不代表你的片段能擴增出來，特別是你如果擴增基因全長的時候，因為ACTION往往豐度高，即使有部分RNA降解也很可能有全長。另外即使沒有全長ACTIN，你設(shè)計的引物如果不再整個序列的前端，這個也是說明不了模版質(zhì)量的，總之a(chǎn)ctin的設(shè)計，一定要設(shè)計在序列比較靠末端的位置，用actin檢測模版質(zhì)量，至少需要稀釋100倍檢測。這個是我們實驗室的玩法，非常有效.所以，你應(yīng)該考慮重新提取RNA或者重新反轉(zhuǎn)錄試試結(jié)果。 一點個人看法，希望對你有用，祝實驗成功 |
2樓2011-10-11 09:09:25
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