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angjzy

木蟲 (小有名氣)

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[求助] 做cDNA的PCR擴(kuò)增沒有結(jié)果呀！

做了一個(gè)cDNA，用這段基因擴(kuò)增actin做陽性對(duì)照，能擴(kuò)增出正確片段。
說明體系、模板都沒問題。

用目的基因特異引物擴(kuò)增，怎么也擴(kuò)不出來。
這個(gè)引物以前有師兄用過，能正確擴(kuò)出目的片段。
說明引物序列沒問題。

但現(xiàn)在我做怎么也做不出來。
懷疑引物不好用了，
就用了new aliquote 引物，還是擴(kuò)不出來。

求助大蝦們，這是怎么個(gè)情況呀，怎么能把它弄出來呢？

博士剛開始，就遇到這種問題，崩潰ing~~~

[ Last edited by angjzy on 2011-10-11 at 04:33 ]

回復(fù)此樓

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1樓 2011-10-11 04:17:20

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2011-10-11 09:25:41
angjzy(金幣+3): 太謝謝了，我試試。希望大家都順利哈 2011-10-12 01:46:27

呵呵分子方面的實(shí)驗(yàn)就是這個(gè)樣子的總有些說不清道不明的原因
樓主這種原因我以前也經(jīng)常遇到，有時(shí)候重復(fù)做幾次PCR就能出來，有時(shí)候就是死命都沒結(jié)果。
我的建議就是
1.先重復(fù)幾次實(shí)驗(yàn)，有時(shí)候會(huì)由于一些比較低級(jí)的問題，比如忘加某組分，或者忘記離心，或者其他由于誤差等等原因產(chǎn)生，會(huì)出不來結(jié)果，有時(shí)候同樣的東西，做兩個(gè)重復(fù)也會(huì)一個(gè)出一個(gè)不出，我把這個(gè)歸結(jié)為人品不好，暴率比較低的緣故。
2.要弄清楚你擴(kuò)增片段所處整個(gè)mRNA的位置，說簡單點(diǎn)，你的ACTIN能擴(kuò)出來不代表你的片段能擴(kuò)增出來，特別是你如果擴(kuò)增基因全長的時(shí)候，因?yàn)锳CTION往往豐度高，即使有部分RNA降解也很可能有全長。另外即使沒有全長ACTIN，你設(shè)計(jì)的引物如果不再整個(gè)序列的前端，這個(gè)也是說明不了模版質(zhì)量的，總之a(chǎn)ctin的設(shè)計(jì)，一定要設(shè)計(jì)在序列比較靠末端的位置，用actin檢測(cè)模版質(zhì)量，至少需要稀釋100倍檢測(cè)。這個(gè)是我們實(shí)驗(yàn)室的玩法，非常有效.所以，你應(yīng)該考慮重新提取RNA或者重新反轉(zhuǎn)錄試試結(jié)果。

一點(diǎn)個(gè)人看法，希望對(duì)你有用，祝實(shí)驗(yàn)成功

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可以用QQ找我……

2樓2011-10-11 09:09:25

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