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小六琦琦新蟲 (初入文壇)
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[求助]
1700基因的克隆 已有3人參與
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最近在克隆一個(gè)1700bp的基因，引物是根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)的。因?yàn)槭侨L， 所以引物沒辦法多選，只能是起始密碼子開始，到終止密碼子，但是無論怎么P，都P不出來~然后又做了一個(gè)3’RACE，得到了終止密碼子后面的序列，根據(jù)3‘RACE的序列設(shè)計(jì)下游引物，依然P不出來~ 但是單加一個(gè)全長正（反）引物，與一個(gè)中間位置的反（正）引物一起P，可以擴(kuò)增上游1300bp，下游1200bp的片段， 曾經(jīng)也拿Mix P出過一次1700的全長，但是因?yàn)槭荕ix，有錯(cuò)配，不能用~ 以后拿LA Taq酶P，就再也消失不見了、、、、 但是能證明轉(zhuǎn)錄組序列是對(duì)的~ 求各位大神指教，這是為什么呢？下一步該怎么做呢？ 是引物的問題呢？還是模板有高級(jí)結(jié)構(gòu)呢？ |
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zhaodahe
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7樓2014-12-29 10:53:34
2樓2014-12-28 23:26:43
zhaodahe
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【答案】應(yīng)助回帖
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我覺得你這種情況，可以這樣，在上游1300和下游1200的重疊區(qū)試著找個(gè)酶切位點(diǎn)，通過這個(gè)酶切位點(diǎn)把兩段分別連載體上，得到全長；或者用此兩段同時(shí)做模版，全長的一對(duì)引物擴(kuò)增，也許會(huì)比cDNA做模板效果好也不一定。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
3樓2014-12-29 06:29:26
小六琦琦
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4樓2014-12-29 09:28:58
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