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小胖芙芙新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助！！短片段（169 bp）PCR擴(kuò)增，用Takara La Taq酶，不出條帶呀。。。。 已有5人參與
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 小白第一次發(fā)帖，各位大神見諒。。。。以前用普通的2×Taq PCR Mix擴(kuò)增，它含的酶是Taq DNA Polymerase，擴(kuò)增條帶是169 bp，當(dāng)時(shí)可以出條帶，亮度可以。也送測了的，返回結(jié)果有的位點(diǎn)是雙峰。 因?yàn)樘岬腄NA是混合物，現(xiàn)在想做克隆看看混合物的成分，就換成了Takara的La taq，但是不出條帶了呀。。。引物沒變，PCR條件也沒變。。。。 我的條件是這樣的： （1）94℃ 5min （2）94℃ 30s （3）51 ℃ 30s （4）72℃ 45s （5）（2）-（4）39 （6）72℃ 10min （7）4℃ forever 求各位大神幫幫忙，看看有沒有啥問題啊。。。。   有啥沒說到的，各位大神盡管問。。。。。 |
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2樓2016-03-06 07:24:03
fudan671
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3樓2016-03-06 07:43:36
yilberg
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4樓2016-03-06 08:38:41
jackyoung
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重新摸索條件是正道，這么點(diǎn)兒的片段用LA Taq有點(diǎn)兒浪費(fèi)了。Anyway,最忌諱這種一個(gè)條件P到底的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2016-03-06 08:45:55
hanxiaominhu
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6樓2016-03-06 08:46:12
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第一點(diǎn)，雙峰的結(jié)果是不是你想要的結(jié)果？不是的話，麻煩你的引物重新設(shè)計(jì)，不夠特異性，第二點(diǎn)，你可以用高保真酶就可以啊，La酶是長片段擴(kuò)增用的吧？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
7樓2016-03-06 09:07:56
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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不到200的片段用普通酶應(yīng)該可以拿到正確的序列的，突變率還是比較低的，對(duì)于你測序是雙峰，不知道你送測的樣品是什么？測序結(jié)果一點(diǎn)正確的都沒有？如果是PCR產(chǎn)物，建議將pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收或者過柱純化后測序，另一個(gè)辦法即將pcr產(chǎn)物連接到T載體測序。另外實(shí)驗(yàn)中不同的酶更換后，條件還是要重新摸索的，特別退火溫度，因?yàn)榻?jīng)常會(huì)出現(xiàn)普通酶可以而高保真的酶不行。我不太清楚第二種酶的延伸速度，不到200的片段應(yīng)該不用那么長延伸時(shí)間吧，循環(huán)數(shù)也適當(dāng)減少些，祝好！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
8樓2016-03-06 09:12:52
小胖芙芙
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溶液體系是: LA Taq 0.25微升 pcr buffer 2.5微升 dNTP Mix 2微升 primers 1/1微升 ddH2O 17.25微升 DNA 1微升 對(duì)了，LA taq是125U的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-03-06 10:06:20
小胖芙芙
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送紅花一朵 |
開始想的是用LA就可以不用單獨(dú)加A尾了，它確實(shí)是擴(kuò)長的，以前用它擴(kuò)過500bp的片段是沒有問題的。循環(huán)數(shù)我也試著降一下吧，謝謝。。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-03-06 10:16:41
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