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烏托小邦木蟲 (正式寫手)
小蟲蟲
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[求助]
關于Cas9-sgRNA構建的困惑，質粒一直提不出來，向大家求助！！
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最近在試著做Cas9，想敲掉一個基因，選擇了六個靶點。其中四個sgRNA很順利就連進Cas9載體了，但是有兩個靶點的sgRNA死活弄不出來，退火-連接-轉化-挑斑-菌液PCR都沒有問題（菌液PCR100%正確），然后我就抽提質粒送去測序。 1）測序公司告訴我質粒電泳沒有條帶，一片模糊； 2）我就自己也跑了電泳，確實永遠都是一片模糊的； 3）然后我就懷疑是不是質粒抽提試劑盒壞了，我就直接拿菌液送去測序，測序公司（兩家）也說抽提不出來質粒； 4）但是我拿菌液劃線，是能正常長斑的； 5）抽提的質粒重新轉化卻啥也沒長； 6）換了一家合成引物的公司，重新合成引物，結果依舊； 7）已經(jīng)做了三次了，抽提試劑盒也換了新的，都是這樣的，問題到底出在哪里呢？有這方面經(jīng)驗的大神能指點一下不？ 我用的這個載體是14kb，是因為載體太大嗎？如果是這個原因的話，為什么另外四個很順利成功呢？ 關于Cas9技術，我今年剛接觸，不是太懂，異想天開一下：會不會是這兩個靶點跟component cell里的某個基因匹配，cas9在component cell里發(fā)生切割作用了？（我也不知道這個時候Cas9是否能發(fā)揮作用，實在是想不出問題在哪，瞎猜的。。） 求幫助，求指點！ |
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-08-09 07:44:31
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-08-09 07:44:31
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說一下你的異想天開真的是異想天開了，首先:cas9是蛋白，你構建的質粒，這時cas9還不會表達呢;其次你連得靶點是不帶pam序列的，cas9切割就是靠著你的靶點與基因組含pam序列的位點匹配后發(fā)生切割作用的。我也在做，不過我們的靶點和cas是分開合的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-08-08 22:28:58
yunsmile2016
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4樓2016-08-06 08:02:57
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10樓2016-08-13 16:14:39
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