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烏托小邦木蟲 (正式寫手)
小蟲蟲
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[求助]
關(guān)于Cas9-sgRNA構(gòu)建的困惑，質(zhì)粒一直提不出來(lái)，向大家求助�。�
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最近在試著做Cas9，想敲掉一個(gè)基因，選擇了六個(gè)靶點(diǎn)。其中四個(gè)sgRNA很順利就連進(jìn)Cas9載體了，但是有兩個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA死活弄不出來(lái)，退火-連接-轉(zhuǎn)化-挑斑-菌液PCR都沒(méi)有問(wèn)題（菌液PCR100%正確），然后我就抽提質(zhì)粒送去測(cè)序。 1）測(cè)序公司告訴我質(zhì)粒電泳沒(méi)有條帶，一片模糊； 2）我就自己也跑了電泳，確實(shí)永遠(yuǎn)都是一片模糊的； 3）然后我就懷疑是不是質(zhì)粒抽提試劑盒壞了，我就直接拿菌液送去測(cè)序，測(cè)序公司（兩家）也說(shuō)抽提不出來(lái)質(zhì)粒； 4）但是我拿菌液劃線，是能正常長(zhǎng)斑的； 5）抽提的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化卻啥也沒(méi)長(zhǎng)； 6）換了一家合成引物的公司，重新合成引物，結(jié)果依舊； 7）已經(jīng)做了三次了，抽提試劑盒也換了新的，都是這樣的，問(wèn)題到底出在哪里呢？有這方面經(jīng)驗(yàn)的大神能指點(diǎn)一下不？ 我用的這個(gè)載體是14kb，是因?yàn)檩d體太大嗎？如果是這個(gè)原因的話，為什么另外四個(gè)很順利成功呢？ 關(guān)于Cas9技術(shù)，我今年剛接觸，不是太懂，異想天開一下：會(huì)不會(huì)是這兩個(gè)靶點(diǎn)跟component cell里的某個(gè)基因匹配，cas9在component cell里發(fā)生切割作用了？（我也不知道這個(gè)時(shí)候Cas9是否能發(fā)揮作用，實(shí)在是想不出問(wèn)題在哪，瞎猜的。。） 求幫助，求指點(diǎn)！ |
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9樓2016-08-12 22:39:31
yunsmile2016
新蟲 (小有名氣)
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2樓2016-08-03 23:13:55
3樓2016-08-06 00:32:08
不吃M的魚
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- 專業(yè): 生物物理、生物化學(xué)與分子
4樓2016-08-06 08:02:57
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