 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 4640 | 回復(fù): 15 | |||
烏托小邦木蟲 (正式寫手)
小蟲蟲
|
[求助]
關(guān)于Cas9-sgRNA構(gòu)建的困惑，質(zhì)粒一直提不出來，向大家求助！！
|
||
|
最近在試著做Cas9，想敲掉一個基因，選擇了六個靶點。其中四個sgRNA很順利就連進Cas9載體了，但是有兩個靶點的sgRNA死活弄不出來，退火-連接-轉(zhuǎn)化-挑斑-菌液PCR都沒有問題（菌液PCR100%正確），然后我就抽提質(zhì)粒送去測序。 1）測序公司告訴我質(zhì)粒電泳沒有條帶，一片模糊； 2）我就自己也跑了電泳，確實永遠都是一片模糊的； 3）然后我就懷疑是不是質(zhì)粒抽提試劑盒壞了，我就直接拿菌液送去測序，測序公司（兩家）也說抽提不出來質(zhì)粒； 4）但是我拿菌液劃線，是能正常長斑的； 5）抽提的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化卻啥也沒長； 6）換了一家合成引物的公司，重新合成引物，結(jié)果依舊； 7）已經(jīng)做了三次了，抽提試劑盒也換了新的，都是這樣的，問題到底出在哪里呢？有這方面經(jīng)驗的大神能指點一下不？ 我用的這個載體是14kb，是因為載體太大嗎？如果是這個原因的話，為什么另外四個很順利成功呢？ 關(guān)于Cas9技術(shù)，我今年剛接觸，不是太懂，異想天開一下：會不會是這兩個靶點跟component cell里的某個基因匹配，cas9在component cell里發(fā)生切割作用了？（我也不知道這個時候Cas9是否能發(fā)揮作用，實在是想不出問題在哪，瞎猜的。。） 求幫助，求指點！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有159人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學院食品與化學工程學院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
不吃M的魚
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 2134.6
- 紅花: 1
- 帖子: 78
- 在線: 17.4小時
- 蟲號: 1646205
- 注冊: 2012-02-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
★ ★
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-08-09 07:44:31
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2016-08-09 07:44:31
|
說一下你的異想天開真的是異想天開了，首先:cas9是蛋白，你構(gòu)建的質(zhì)粒，這時cas9還不會表達呢;其次你連得靶點是不帶pam序列的，cas9切割就是靠著你的靶點與基因組含pam序列的位點匹配后發(fā)生切割作用的。我也在做，不過我們的靶點和cas是分開合的。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2016-08-08 22:28:58
yunsmile2016
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 265.3
- 散金: 90
- 紅花: 2
- 帖子: 163
- 在線: 15.8小時
- 蟲號: 4863857
- 注冊: 2016-07-23
- 專業(yè): 組織工程與再生醫(yī)學
2樓2016-08-03 23:13:55
3樓2016-08-06 00:32:08
不吃M的魚
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 2134.6
- 紅花: 1
- 帖子: 78
- 在線: 17.4小時
- 蟲號: 1646205
- 注冊: 2012-02-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
4樓2016-08-06 08:02:57
烏托小邦
木蟲 (正式寫手)
小蟲蟲
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 5132.5
- 散金: 275
- 紅花: 10
- 帖子: 469
- 在線: 210.2小時
- 蟲號: 1221588
- 注冊: 2011-03-04
- 性別: GG
- 專業(yè): 支氣管哮喘
5樓2016-08-08 10:19:24
烏托小邦
木蟲 (正式寫手)
小蟲蟲
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 5132.5
- 散金: 275
- 紅花: 10
- 帖子: 469
- 在線: 210.2小時
- 蟲號: 1221588
- 注冊: 2011-03-04
- 性別: GG
- 專業(yè): 支氣管哮喘
6樓2016-08-08 10:19:51
8樓2016-08-12 17:41:31
9樓2016-08-12 22:39:31
wenf98
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 1016.7
- 散金: 604
- 紅花: 6
- 帖子: 401
- 在線: 260.4小時
- 蟲號: 282716
- 注冊: 2006-09-24
- 性別: GG
- 專業(yè): 化學生物學與生物有機化學
10樓2016-08-13 16:14:39
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 烏托小邦 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 300求調(diào)劑，材料科學英一數(shù)二 +13 | leaflight 2026-03-24 | 13/650 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學 +13 | 妮妮ninicgb 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 材料專碩調(diào)劑 +6 | 椰椰。 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京工業(yè)大學，324分求調(diào)劑 +6 | 零八# 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 070300化學354求調(diào)劑 +6 | 101次希望 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 求收留 +5 | 1943443204 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +13 | 新時代材料 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 一志愿太原理工安全工程300分，求調(diào)劑 +5 | 0857求調(diào)劑. 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 11408軟件工程求調(diào)劑 +3 | Qiu學ing 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 339求調(diào)劑，想調(diào)回江蘇 +6 | 烤麥芽 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑推薦 材料 304 +15 | 荷包蛋hyj 2026-03-26 | 15/750 |
|
|
|
[考研] 07化學280分求調(diào)劑 +10 | 722865 2026-03-23 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 0703化學338求調(diào)劑！ +6 | Zuhui0306 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +6 | Ymlll 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 機械學碩310分，數(shù)一英一，一志愿211本科雙非找調(diào)劑信息 +3 | @357 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +6 | 藍山月 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +7 | 加一一九 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +3 | iwinso 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 340求調(diào)劑 +5 | 話梅糖111 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +3 | desto 2026-03-24 | 3/150 |
|