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[求助]
融合PCR引物的設(shè)計 已有4人參與
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需要在基因A和基因B之間加上一個linker，就是“基因A+linker+基因B”。linker的編碼序列為CTGGTGCCGCGTGGTAGC�，F(xiàn)在只有基因A和基因B的模板，想通過重疊延伸PCR將3個片段連接起來，但不知道具體該怎樣設(shè)計引物，求助各位高手提供寶貴意見。 A基因:ATGCCGTTTGTGAATAAACAGTTTAATTACAAGGATCCGGTGAATGGCGTGGACATCGCCTATATTAAAATCCCGAACGCCGGCCAGATGCAGCCGGTGAAGGCATTTAAGATTCATAATAAAATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTTACAAACCCTGAAGAAGGTGACCTGAATCCTCCGCCGGAAGCAAAACAGGTGCCGGTTAGCTACTACGACAGCACCTACCTGAGCACCGATAACGAGAAAGACAATTATCTGAAAGGTGTGACCAAACTGTTTGAACGTATTTACAGCACCGATCTGGGCCGTATGCTGCTGACAAGCATCGTTCGTGGCATTCCGTTTTGGGGTGGCAGCACCATTGACACCGAGCTGAAAGTGATTGACACAAACTGCATTAATGTGATTCAGCCGGATGGCAGCTATCGTAGTGAGGAGCTGAACCTGGTGATTATCGGCCCGAGCGCCGATATTATCCAGTTCGAATGCAAAAGCTTCGGCCACGAAGTGCTGAATCTGACCCGCAATGGCTACGGTAGCACCCAGTATATTCGCTTCAGCCCGGACTTCACCTTCGGCTTCGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTACTGGGTGCCGGTAAGTTTGCCACCGATCCGGCAGTGACCCTGGCCCATGAATTAATCCACGCCGGCCATCGTCTGTACGGCATCGCCATCAATCCGAACCGCGTTTTTAAAGTTAATACAAACGCCTATTATGAGATGAGCGGCCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAGCTGCGCACCTTTGGCGGCCATGACGCCAAATTCATCGACAGCCTGCAGGAAAATGAGTTTCGCCTGTATTATTACAATAAATTTAAAGACATCGCAAGCACACTGAACAAAGCAAAAAGCATTGTTGGCACCACCGCCAGCCTGCAGTACATGAAGAACGTGTTTAAAGAAAAATATCTGCTGAGCGAAGACACCAGCGGCAAGTTTAGCGTTGACAAACTGAAATTCGACAAACTGTATAAGATGCTGACCGAGATCTACACAGAGGACAACTTTGTTAAATTTTTCAAAGTTCTGAATCGCAAAACCTATCTGAACTTTGATAAAGCCGTTTTCAAAATTAATATTGTGCCTAAGGTTAACTATACTATTTACGATGGTTTTAACCTGCGCAACACCAACCTGGCAGCAAACTTTAATGGCCAAAATACCGAAATTAATAATATGAATTTTACCAAACTGAAAAATTTCACCGGTCTGTTCGAGTTCTACAAGCTGCTGTGCGTGCGTGGCATCATCACCAGCAAA B基因:GCCTTAAACGATCTGTGCATTAAAGTTAACAACTGGGATCTGTTCTTTAGTCCGAGTGAAGATAATTTCACCAATGATCTGAATAAGGGCGAAGAAATTACCAGCGATACAAATATTGAGGCCGCCGAGGAGAACATTAGCTTAGATTTAATTCAGCAATATTACCTGACCTTCAACTTCGACAACGAGCCGGAGAACATCAGCATCGAGAATCTGAGCAGCGATATCATCGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAGCGCTTTCCTAACGGTAAGAAATATGAGCTGGACAAATATACCATGTTTCACTATCTGCGCGCCCAGGAATTTGAGCACGGTAAGAGCCGCATCGCCCTGACAAATAGCGTGAACGAGGCCCTGCTGAACCCTAGCCGCGTGTACACATTTTTCAGCAGCGATTACGTGAAAAAAGTTAACAAGGCCACAGAGGCCGCCATGTTCTTAGGCTGGGTTGAGCAGCTGGTGTATGACTTCACCGATGAGACCAGCGAAGTGAGCACCACCGACAAGATTGCCGACATTACCATCATCATCCCTTATATTGGCCCGGCCCTGAATATCGGTAATATGCTGTATAAAGATGACTTCGTGGGCGCACTGATCTTCAGCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTTATCCCGGAGATCGCAATCCCGGTGCTGGGCACATTTGCACTGGTGAGCTATATCGCCAACAAAGTGCTGACCGTTCAGACCATCGACAACGCACTGAGCAAACGTAATGAAAAATGGGATGAGGTGTATAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGCCAAAGTGAATACCCAGATCGACTTAATCCGCAAGAAGATGAAGGAAGCCCTGGAAAACCAGGCAGAAGCCACAAAAGCCATCATCAACTATCAATACAATCAATATACCGAAGAAGAGAAAAATAATATTAATTTTAATATCGATGATTTAAGCAGTAAACTGAATGAAAGTATTAATAAAGCCATGATCAATATTAATAAGTTTCTGAATCAGTGTAGCGTGAGCTATCTGATGAACAGCATGATCCCGTACGGCGTGAAGCGTCTGGAAGATTTCGATGCCAGCCTGAAGGATGCACTGTTAAAATATATTTACGATAATCGCGGCACCCTGATCGGTCAGGTTGATCGCCTGAAAGATAAGGTGAATAACACCTTAAGCACCGATATCCCGTTTCAGCTGAGCAAATACGTGGACAACCAGCGCCTGCTGAGTACCTTTACCGAGTACATCAAAAACATTATTAATACCAGCATCTTAAACCTGCGCTACGAGAGTAATCACCTGATCGACCTGAGCCGCTACGCCAGCAAGATCAACATCGGCAGCAAAGTGAACTTTGATCCGATTGATAAGAATCAGATTCAGCTGTTTAACTTAGAAAGCAGTAAAATTGAGGTGATTCTGAAAAATGCCATCGTGTACAATAGCATGTATGAAAATTTCAGCACCAGTTTTTGGATCCGCATCCCGAAGTACTTCAATAGCATCAGTTTAAACAATGAGTATACCATTATTAACTGTATGGAAAATAACAGTGGCTGGAAAGTGAGCCTGAATTACGGTGAGATCATCTGGACACTGCAGGATACCCAGGAGATTAAACAGCGCGTTGTTTTTAAGTATAGCCAGATGATCAACATCAGCGACTATATTAATCGTTGGATTTTCGTTACCATCACCAATAATCGCCTGAACAATAGTAAAATCTATATTAACGGCCGCCTGATCGACCAGAAACCGATCAGCAACCTGGGTAACATTCATGCCAGCAACAATATCATGTTTAAGTTAGATGGTTGCCGCGACACCCACCGCTATATTTGGATCAAATATTTCAACCTGTTCGACAAAGAATTAAATGAAAAAGAAATTAAAGACCTGTATGATAATCAAAGCAATAGTGGCATCCTGAAAGATTTTTGGGGCGACTACCTGCAGTATGATAAGCCGTACTATATGTTAAATCTGTACGATCCTAATAAATATGTTGATGTGAACAACGTGGGCATTCGCGGCTACATGTATCTGAAGGGCCCTCGCGGTAGTGTGATGACCACCAATATCTATCTGAATAGCAGTCTGTATCGCGGTACCAAATTCATCATCAAAAAGTATGCCAGTGGTAATAAAGACAATATCGTTCGTAACAACGATCGCGTGTACATCAACGTGGTGGTGAAGAATAAGGAGTACCGTCTGGCAACAAACGCCAGTCAGGCCGGTGTTGAGAAGATTCTGAGCGCCTTAGAGATCCCGGACGTGGGCAATCTGAGTCAGGTTGTGGTTATGAAAAGCAAAAATGACCAGGGCATTACAAATAAATGCAAGATGAATCTGCAAGATAACAATGGCAATGATATCGGTTTCATTGGCTTTCACCAGTTCAATAACATCGCCAAGCTGGTGGCCAGCAATTGGTACAACCGCCAAATCGAACGTAGCAGCCGCACACTGGGTTGTAGCTGGGAGTTTATTCCGGTTGACGATGGTTGGGGTGAACGCCCGCTGTAA |
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2樓2017-01-19 14:59:14
梅太奇阿拉干
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2017-01-20 07:52:07
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我不是高手，給你一點提示，你就按引物設(shè)計原則分別設(shè)計擴增geneA和geneB的引物，只不過是A的下游引物和B的上游引物加上linker序列不就行了嗎，注意linker的退火溫度和geneA的上游和geneB的下游相近就ok了，這樣重疊退火時比較容易擴全長。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2017-01-19 21:23:01
yt7777
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設(shè)計四條引物，分別是 geneA和geneB的上下游引物，A的上游引物和B的下游引物正常設(shè)計即可，A的下有引物和B的上游引物需要包含linker序列（可以不全部包括在內(nèi)，但是兩條引物需要有重疊部分），然后先用引物擴增A和B，擴增出來后以擴增出來的A.B為模板，以A的上游引物和B的下游引物擴增A+linker+B序列。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2017-01-20 04:11:46
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已經(jīng)做了一個多月了，還是鏈接不上，引物沒有錯誤，讓一個博士看了一下，引物沒有設(shè)計錯誤，可就是融合不上，然后買了infusion 試劑盒，還是連接不上。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2017-01-21 09:43:36
愛的約定
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可以先把A和B同時連接到T載體上，然后設(shè)計帶linker的引物跨A末尾B開頭，做個反向互補擴全長用Dpn1酶消化模板。可以試下僅供參考 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2017-01-21 13:38:21
10樓2017-01-23 11:43:29
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是兩個片段的連接，分別設(shè)計單獨基因的上下游引物，然后設(shè)計重疊引物，注意前段的連接順序，設(shè)計a的下游重疊引物，b的上游重疊引物，經(jīng)過pcr，最后用a的上游與b的下游作為引物，以各個基因的linker作為模板，可進行融合。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-01-20 01:39:29
6樓2017-01-21 09:41:40
yt7777
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8樓2017-01-21 10:09:42
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