急躁的小脾氣

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[求助] QPCR溶解曲線問(wèn)題

求助大神。。。
開(kāi)始我用普通PCR跑了這對(duì)引物，也跑了膠，結(jié)果還蠻好的，沒(méi)有引物二聚體和非特異性，產(chǎn)物長(zhǎng)度也是對(duì)的，283bp。
但是用QPCR做了之后，大多數(shù)溶解曲線出現(xiàn)雙峰，還有的峰的位置都變了。
求大神賜教，我這種情況是樣本被污染了嗎？

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一個(gè)關(guān)于qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題。謝謝！已經(jīng)有12人回復(fù)
幫我看看這個(gè)溶解qPCR曲線已經(jīng)有6人回復(fù)

1樓 2017-04-10 15:29:23

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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-04-12 22:13:11

確切說(shuō)qPCR條件跟普通pcr條件不一樣，檢測(cè)精度也不一樣，經(jīng)驗(yàn)告訴我用普通pcr檢測(cè)q的不能說(shuō)明什么問(wèn)題。另外電泳的檢測(cè)靈敏度也可能看不到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶，而

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2樓2017-04-10 16:46:38

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有的時(shí)候普通p跑出來(lái)的qpcr也不一定能跑出來(lái)。普通p只是大概看下引物特異性。

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3樓2017-04-10 16:53:36

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4樓: Originally posted by 急躁的小脾氣 at 2017-04-10 21:51:40
那我的結(jié)果里有些溶解曲線是可取的，這幾條能用嗎？
...

溶解曲線單一峰就可用。如果你不考慮擴(kuò)增效率的話(huà)。

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5樓2017-04-10 22:21:59

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niil

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你這個(gè)雜峰的位置可能是引物二聚體，你的實(shí)時(shí)定量pcr程序如何？你用的引物的退火溫度是多少？

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6樓2017-04-11 06:41:09

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3樓: Originally posted by 深海看星 at 2017-04-10 16:53:36
有的時(shí)候普通p跑出來(lái)的qpcr也不一定能跑出來(lái)。普通p只是大概看下引物特異性。

嗯的確是這樣但是我這個(gè)情況貌似和樣本也有關(guān)系，畢竟有些樣本的溶解曲線是正常的，但大部分樣本p出來(lái)的出現(xiàn)的可能是引物二聚體。

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9樓2017-04-11 08:47:11

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2樓: Originally posted by idealgas at 2017-04-10 16:46:38
確切說(shuō)qPCR條件跟普通pcr條件不一樣，檢測(cè)精度也不一樣，經(jīng)驗(yàn)告訴我用普通pcr檢測(cè)q的不能說(shuō)明什么問(wèn)題。另外電泳的檢測(cè)靈敏度也可能看不到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶，而
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那我的結(jié)果里有些溶解曲線是可取的，這幾條能用嗎？

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4樓2017-04-10 21:51:40

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6樓: Originally posted by niil at 2017-04-11 06:41:09
你這個(gè)雜峰的位置可能是引物二聚體，你的實(shí)時(shí)定量pcr程序如何？你用的引物的退火溫度是多少？

退火溫度是54℃，程序是：95℃預(yù)變性3min，變性10s，54度10s，72℃15s，40個(gè)循環(huán)，65℃（0:05），升溫到95℃
樣本不同，產(chǎn)生引物二聚體的情況不同，總共有24個(gè)樣本，只有幾條是沒(méi)有出現(xiàn)引物二聚體的。

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8樓2017-04-11 08:45:06

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10樓2017-04-12 22:09:29

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