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邢曙光木蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于連接轉(zhuǎn)化的問題 已有1人參與
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酶切800bp的片段連接5800bp的載體，酶切4000bp的片段連接5800bp的載體，連接完了用T7通用引物來p，能夠p出來，然后用連接體系去轉(zhuǎn)化，平板什么也不長，我用提好的別的質(zhì)粒做對(duì)照，長滿了一平板，求助我這是什么問題，做了三個(gè)月的連接轉(zhuǎn)化了，再做不出來就想換課題了，求各位大神幫我分析是哪里出了問題 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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jcstone1027
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2樓2017-06-16 11:00:25
邢曙光
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Cas9是23.3納克每微升，表達(dá)載體是18.8納克每微升，試過載體與片段1:3，1:4，1:5，1:6這樣的配比都沒有結(jié)果，重新?lián)Q了新感受態(tài)還是不行真無奈 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2017-06-16 15:38:51
jcstone1027
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-06-17 07:45:47
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-06-17 07:45:47
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就是說你PCR驗(yàn)證的時(shí)候就是用通用引物和序列引物驗(yàn)的嗎，如果是這樣的話，那就可以排除酶切的問題了，實(shí)際上我覺得你還是需要提高片段濃度，比例這些沒那么嚴(yán)格，我之前出過問題，罕見的是連接酶有問題，連接效率過低，因?yàn)镻CR很靈敏，擴(kuò)出來不代表一定能轉(zhuǎn)化出來，所以就是濃度，還有可以考慮下連接酶的問題。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
4樓2017-06-16 16:14:18
kangaroo0513
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5樓2017-06-16 22:14:08
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6樓2017-12-27 01:33:49
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